मल्टीपल स्केलेरोसिस के साथ व्यक्तियों के लिए व्यापक Autopsy कार्यक्रम

हमारे शोध का लक्ष्य मल्टीपल स्क्लेरोसिस के रोगजनन का अध्ययन करना है। इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए हम प्राप्त करने के लिए और एमएस के साथ व्यक्तियों से दिमाग का अध्ययन करने के लिए एक तेजी से शव परीक्षण कार्यक्रम की स्थापना की है । हमारे ऑटोप्सी कार्यक्रम के दो विशेष पहलू हैं, पहला यह है कि यह तेजी से है। हम मस्तिष्क की मृत्यु के छह से आठ घंटे के तहत इकट्ठा करते हैं।

यह कला आणविक अध्ययन के राज्य के लिए अनुमति देता है। दूसरा पहलू यह है कि हम मस्तिष्क को स्थानांतरित करने से पहले सीटू एमआरआई में करते हैं। यह हमें मस्तिष्क इमेजिंग परिवर्तन के साथ रोग परिवर्तन सहसंबंधित करने के लिए अनुमति देता है।

दृश्य प्रदर्शन दर्शकों को यह समझने की अनुमति देता है कि हम इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए अपने स्थान और समय को कैसे व्यवस्थित करते हैं। ऊतक प्रसंस्करण जो तेजी से होता है और ध्यान से आरएनए विश्लेषण, इम्यूनोदाता, इम्यूनोब्लोटिंग और एमआरआई सहसंबंधों के लिए अनुमति देता है। नए शोधकर्ताओं गरीब ऊतक अखंडता के साथ ऊतकों प्रसंस्करण के साथ संघर्ष कर सकते हैं ।

लंबे समय से पोस्टमार्टम निर्धारण समय से बचना महत्वपूर्ण है और एमआरआई ऊतक कॉर्ड स्ट्रिशन चुनौतीपूर्ण हो सकता है इसलिए एमआरआई विश्लेषण विशेषज्ञों के साथ परामर्श बहुत उपयोगी हो सकता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन एमिली क्रिस्टी और क्रिस्टीना Volsko होगा । हमारी प्रयोगशाला से तकनीशियनों ।

सीटू चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग में, मस्तिष्क का वजन और फोटोग्राफ करें और किसी भी संलग्न ड्यूरा को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड या पीएफए के कंटेनर में रखें। सेरिबैलम और ब्रेनस्टेम को सेरेब्रम से अलग करें और सेरेब्रम की तस्वीर लगाएं। ऑप्टिक नसों, चियाम और ट्रैक्ट को अलग करने और एक स्केलपेल के साथ संरचना को फिर से काटना करने के लिए एक जांच का उपयोग करें।

सेरेब्रल गोलार्द्धों को देशांतर से अलग करें और प्रत्येक गोलार्द्ध को व्यक्तिगत रूप से फोटोग्राफ करें। बाएं गोलार्द्ध के लिए प्राथमिक मोटर कॉर्टेक्स या पीएमसी को स्याही दें, ऊतक को फिर से फोटोग्राफ करें और ऊतक को लंबे निर्धारण के लिए 3.3 लीटर कंटेनर में रखें। सही गोलार्द्ध के लिए पीएमसी को उत्पादित करने के लिए कवर मेनिंग को हटा दें और ऊतक को फिर से फोटोग्राफ करें।

अगला स्केलपेल का उपयोग करके पीएमसी को फिर से काटना। फिर गोलार्द्ध के बगल में पुनः प्राप्त पीएमसी की तस्वीर। पीएमसी को छह समान आकार के वर्गों में काटें और प्रत्येक खंड के रोस्ट्रल पहलू पर स्याही लगाएं।

फिर छोटे निर्धारण के लिए पीएफए भरे कंटेनरों में हर दूसरे खंड रखें। और स्नैप सील फ्रीजर बैग में भंडारण के लिए शेष वर्गों फ्रीज, कूलर नंबर एक में । एक सेंटीमीटर मोटी कोरोनल वर्गों में पीछे के लिए सही गोलार्द्ध पूर्वकाल काटें।

पीएफए में हर दूसरे अनुभाग को ठीक करें और कूलर नंबर एक में सील फ्रीजर बैग में भंडारण के लिए शेष वर्गों को फ्रीज करें। ब्रेनस्टेम को सेरिबैलम से अलग करें और शॉर्ट फिक्सेशन के लिए ब्रेनस्टेम को पीएफए भरे कंटेनर में रखें। प्रत्येक सेरिबेलर गोलार्द्ध को चार समान रूप से तय धनु वर्गों में काटें और मध्य और पार्श्व विचारों की तस्वीर लें।

फिर बाएं सेरिबेलर हेमिस्फेरिक स्लाइस को अल्प निर्धारण के लिए पीएफए के कंटेनर में रखें। और स्नैप सील फ्रीजर बैग में भंडारण के लिए सही सेरिबेलर हेमिस्फेरिक स्लाइस फ्रीज, कूलर नंबर एक में । तंत्रिका जड़ों के साथ रीढ़ की हड्डी प्राप्त करने के बाद रीढ़ की हड्डी ड्यूरा मेटर को हटा दें और दउरा को पीएफए में स्टोर करें।

बाएं और दाएं पूर्वकाल और पीछे की तंत्रिका जड़ों को अलग करें और पीएफए में लघु निर्धारण के लिए रीढ़ की हड्डी से बाएं पूर्वकाल और पीछे की तंत्रिका जड़ों को काटें। रीढ़ की हड्डी के तार से सही पूर्वकाल और पीछे तंत्रिका जड़ों को काटें और स्नैप इन ऊतकों को सील फ्रीजर बैग में भंडारण के लिए फ्रीज करें, कूलर नंबर दो में। फिर कौडल-रीढ़ की हड्डी के सबसे 20 सेंटीमीटर की तस्वीर और पीएफए लघु निर्धारण और स्नैप फ्रीजिंग के लिए कॉर्ड की रोड्रल दिशा में कौडल से दो सेंटीमीटर स्थानांतरण अनुभागों को काटा।

इसके बाद रीढ़ की हड्डी के बचे हुए रोस्ट्रल हिस्से की फोटो खींचें। और पीएफए लघु निर्धारण और स्नैप फ्रीजिंग के लिए कॉर्ड की रोड्रल दिशा में कौडल से दो सेंटीमीटर स्थानांतरण अनुभागों में कटौती करें। छोटे या लंबे समय तक तय ऊतकों से ब्याज के वर्गों में कटौती करें।

एक छह अच्छी तरह से थाली के व्यक्तिगत कुओं में वर्गों प्लेस और धोने के प्रति ताजा PBS के दो मिलीलीटर में तीन पांच मिनट धोने के साथ ऊतकों धोने, मिलाते हुए के साथ । एंटीजन पुनर्प्राप्ति के लिए, एक ग्लास बीकर में दो से तीन मिनट के लिए वर्गों माइक्रोवेव 10 मिलीमोलर साइट्रेट बफर के लगभग 30 मिलीलीटर युक्त । जब वर्गों कमरे के तापमान के लिए ठंडा है तीन पांच मिनट धोने और PBS के दो मिलीलीटर के लिए एक नई छह अच्छी तरह से थाली में नमूनों हस्तांतरण, प्लस ०.३% Triton X-१०० प्रति अच्छी तरह से, प्रति धोने ।

इसके बाद 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के दो मिलीलीटर में एंडोजेनस पेरोक्सिडेज ब्लॉकिंग प्लस 0.3% ट्राइटन एक्स-100 पीबीएस में 30 मिनट के लिए, कमरे के तापमान पर। इनक्यूबेशन के अंत में, पीबीएस प्लस ट्राइटन एक्स-100 प्रति वॉश के दो मिलीलीटर में तीन बार वर्गों को धोएं, जैसा कि प्रदर्शन किया गया है। इसके बाद कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए 3% सामान्य बकरी सीरम और पीबीएस प्लस ट्राइटन एक्स-१०० के दो मिलीलीटर में अवरुद्ध किया गया ।

इसके बाद, चार डिग्री सेल्सियस पर ब्याज की प्राथमिक एंटीबॉडी में रात से पांच दिनों तक वर्गों को इनक्यूबेट करें और इसके बाद प्रति वॉश पीबीएस के दो मिलीलीटर में तीन पांच मिनट की धुलाई करें । कमरे के तापमान पर, एक घंटे के लिए एविडिन-बायोटिन जटिल समाधान या एबीसी कॉम्प्लेक्स में वर्गों को इनक्यूबेट करें। पीबीएस में तीन पांच मिनट की वॉश के साथ इसका पालन करें।

तीन से आठ मिनट के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ पूरक फ़िल्टर किए गए डायामिनोबेन्ज़िडीन के दो मिलीलीटर के साथ अनुभागों को लेबल करें। जब रंग पर्याप्त रूप से विकसित हो गया है, तो पीबीएस में तीन बार वर्गों को धोएं और व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक अनुभाग को पीबीएस भरे कंटेनर में स्थानांतरित करें। प्रत्येक अनुभाग को अलग-अलग टिश्यू स्लाइड के तहत साफ-साफ रखें।

और धीरे से पीबीएस से बाहर प्रत्येक स्लाइड लिफ्ट, संभव के रूप में फ्लैट के रूप में वर्गों रखते हुए । धीरे-धीरे समतल और प्रत्येक ऊतक को बाहर फैलाने के लिए दो तूलिका का उपयोग करें। और अतिरिक्त पानी को दूर करने के लिए एक कागज तौलिया का उपयोग करें।

फिर एक उपयुक्त बढ़ते माध्यम के साथ वर्गों माउंट और स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ प्रत्येक कवर पर्ची सील । ऊतक वर्गों सफेद पदार्थ घावों की उपस्थिति के लिए जांच कर रहे हैं और चयनित क्षेत्रों प्रतिरक्षा गतिविधि और demyelination के लिए दाग रहे हैं। तीव्र मल्टीपल सेलेरिस घावों में इनमें से कई डिमीलिनेटेड एक्सॉन एक्सोन रिऐक्शन बल्ब के रूप में कार्य करते हैं जो ट्रांसेक्टेड एक्सॉन के समीपस्थ सिरों को दर्शाते हैं।

तीव्र घावों में ट्रांसेक्टेड एक्सॉन का घनत्व आसन्न गैर-घावीय सफेद पदार्थ क्षेत्रों में सिर्फ 15 की तुलना में सक्रिय घावों में 11000 प्रति घन मिलीमीटर से अधिक है। कई क्रोनिक एमएस घावों में नए जनित ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स भी मौजूद हैं। ये प्रक्रियाएं सहयोगी हैं लेकिन रहस्यमयीकृत एक्सॉन को नहीं करती हैं।

एक प्रतिनिधि, क्रोनिक एमएस रोगियों से प्राप्त तेजी से जमे हुए मोटर कॉर्टेक्स्ट में न्यूरोनल जीन परिवर्तन के लिए निष्पक्ष खोज, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री का उपयोग करके और सीटू संकरण में 23 परमाणु और कोडित माइटोकॉन्ड्रियल मैसेंजर आरएनए के क्रेडेंशियलिंग अध्ययनों में महत्वपूर्ण कटौती की पहचान की गई और सीटू संकरण में संकेत दिया कि ये जीन कॉर्टिकल अनुमान न्यूरॉन्स में अत्यधिक समृद्ध थे और माइटोकॉन्ड्रिया अनुमान से अलग थे myelinated और demyelinated हिप्पोकैम्पी में न्यूरोनोड जीन अभिव्यक्ति की तुलना स्मृति और सीखने में शामिल प्रोटीन सहित न्यूरोनल मैसेंजर आरएनए में कटौती का पता चलता है । इसके अलावा, नियंत्रण कॉर्टिस की तुलना में, कॉर्टिकल न्यूरोनल लॉस एमएस रोगियों की एक उप आबादी में काफी अधिक है जिसमें रीढ़ की हड्डी और सेरेब्रल कॉर्टेक्स्ट का विम्रियलेशन होता है लेकिन सेरेब्रल व्हाइट मैटर का नहीं।

ऊतक प्रसंस्करण के दौरान, सुनिश्चित करें कि जब कोरोनल वर्गों में कटौती की जाती है तो उन्हें मोटाई और अभिविन्यास के संबंध में लगातार काटा जाता है। और यह कि जब वे एक स्थिर में तैरते हैं या जमे हुए होते हैं तो वे फ्लैट झूठ बोलते हैं। इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण के अलावा जमे हुए ऊतक संग्रह हमें आनुवंशिक और प्रोटेओमिक विश्लेषण करने का अवसर प्रदान करता है।

इन तकनीकों एमआरआई पर मस्तिष्क सफेद पदार्थ घावों के साथ एमएस रोगियों की एक नई पलटन की पहचान में सहायता की है, लेकिन किसी भी महत्वपूर्ण सफेद पदार्थ demyelination के बिना । मायलोकॉर्टिकल एमएस करार दिया।