Le but de notre recherche est d’étudier la pathogénie de la sclérose en plaques. Pour atteindre cet objectif, nous avons établi un programme d’autopsie rapide pour obtenir et étudier le cerveau des personnes atteintes de SP. Il y a deux aspects spéciaux de notre programme d’autopsie, le premier est qu’il est rapide. Nous recueillons le cerveau moins de six à huit heures de mort.
Cela permet des études moléculaires à la fine pointe de la technologie. Le deuxième aspect est que nous faisons une IRM in situ avant de déplacer le cerveau. Cela nous permet de corréler les changements pathologiques avec les changements d’imagerie cérébrale.
La démonstration visuelle permet aux spectateurs de comprendre comment nous organisons notre espace et notre temps pour obtenir des résultats optimaux. Le traitement tissulaire qui se produit rapidement et soigneusement permet l’analyse de l’ARN, l’immunostaining, l’immunoblotting et les corrélations IRM. Les nouveaux chercheurs peuvent avoir du mal à traiter les tissus avec une mauvaise intégrité des tissus.
Éviter les longs temps de fixation post mortem est important et les stries de corde de tissu d’IRM peuvent être provocantes ainsi la consultation avec des experts d’analyse de MRI peut être très utile. Emilie Christie et Christina Volsko feront la démonstration de la procédure. Techniciens de notre labo.
Après l’imagerie par résonance magnétique in situ, pesez et photographiez le cerveau et placez n’importe quel dura attaché dans un récipient de 4% paraformaldéhyde ou PFA. Séparez le cervelet et le tronc cérébral du cerveau et photographiez le cerveau. Utilisez une sonde pour séparer les nerfs optiques, le chiasm et les voies et réséquer la structure à l’avec un scalpel.
Séparez les hémisphères cérébraux longitudilement et photographiez chaque hémisphère individuellement. Encrez le cortex moteur primaire ou PMC pour l’hémisphère gauche, rephotographiez le tissu et placez le tissu dans un récipient de 3,3 litres pour une longue fixation. Pour exciser le PMC pour l’hémisphère droit enlever les méninges couvrantes et rephotographier le tissu.
Ensuite, resserré le PMC à l’aide d’un scalpel. Photographiez ensuite le PMC réséqué à côté de l’hémisphère. Couper le PMC en six sections de taille égale et encrer l’aspect rostral de chaque section.
Ensuite, placez toutes les autres sections dans des contenants remplis de PFA pour une fixation courte. Et casser congeler les sections restantes pour le stockage dans des sacs de congélation scellés, dans la glacière numéro un. Couper l’hémisphère droit antérieur à postérieur en sections coronale d’un centimètre d’épaisseur.
Fixez toutes les autres sections de la PFA et congelez les sections restantes pour les entreposer dans des sacs de congélation scellés, dans le refroidisseur numéro un. Séparez le tronc cérébral du cervelet et placez le tronc cérébral dans un récipient rempli de PFA pour une fixation courte. Coupez chaque hémisphère cerebellar en quatre sections sagittales tout aussi fixes et photographiez les vues médials et latérales.
Placez ensuite les tranches hémisphériques cebellar gauches dans un récipient de PFA pour une fixation courte. Et casser congeler les bonnes tranches hémisphériques cerebellar pour le stockage dans des sacs de congélation scellés, dans la glacière numéro un. Après avoir obtenu la moelle épinière avec les racines nerveuses enlever la dura mater de la moelle épinière et stocker le dura dans PFA.
Séparez les racines antérieures et postérieures gauches et postérieures de nerf et coupez les racines antérieures et postérieures gauches de nerf de la moelle épinière pour la fixation courte dans PFA. Couper les bonnes racines nerveuses antérieures et postérieures de la moelle épinière et casser geler ces tissus pour le stockage dans des sacs de congélation scellés, dans la glacière numéro deux. Photographiez ensuite le caudal-plus 20 centimètres de la moelle épinière et coupez deux sections de transfert centimètre du caudal à la direction rostrale de la corde pour la fixation courte de PFA et le gel de claquement.
Photographiez ensuite la partie rostrale restante de la moelle épinière. Et couper deux sections de transfert centimètre du caudal à la direction rostrale du cordon pour la fixation courte PFA et casser le gel. Couper les sections d’intérêt des tissus fixes courts ou longs.
Placez les sections dans les puits individuels d’une assiette de six puits et lavez les tissus avec trois lavages de cinq minutes en deux millilitres de PBS frais par lavage, en secouant. Pour la récupération des antigènes, cuire les sections au micro-ondes pendant deux à trois minutes dans un bécher en verre contenant environ 30 millilitres de tampon de citrate de 10 millimollaires. Lorsque les sections ont refroidi à température ambiante transférer les échantillons dans une nouvelle plaque de six puits pour trois lavages de cinq minutes et deux millilitres de PBS, plus 0,3%Triton X-100 par puits, par lavage.
Suivi par le blocage endogène de peroxyde dans deux millilitres de peroxyde d’hydrogène de 3%plus 0.3%Triton X-100 dans PBS pendant 30 minutes, à la température ambiante. À la fin de l’incubation, laver les sections trois fois en deux millilitres de PBS plus Triton X-100 par lavage, comme démontré. Suivi du blocage en deux millilitres de sérum de chèvre normal de 3% et de PBS plus Triton X-100 pendant une heure à température ambiante.
Ensuite, incuber les sections de la nuit à cinq jours dans les anticorps primaires d’intérêt à quatre degrés Celsius suivie de trois lavages de cinq minutes en deux millilitres de PBS par lavage. Incuber les sections dans la solution complexe avidin-biotine ou complexe ABC pendant une heure, à température ambiante. Suivez-le avec trois lavages de cinq minutes dans PBS.
Étiquetez les sections de deux millilitres de diaminobenzidine filtrée complétées par peroxyde d’hydrogène par puits pendant trois à huit minutes. Lorsque la couleur s’est suffisamment développée, lavez les sections trois fois en PBS et transférez individuellement chaque section dans un contenant rempli de PBS. Placez chaque section à plat, sous des diapositives de tissu individuelles.
Et soulevez doucement chaque glissière hors du PBS, en gardant les sections aussi plates que possible. Utilisez deux pinceaux pour aplatir doucement et étirer chaque tissu. Et utilisez une serviette en papier pour tamponner l’excès d’eau.
Montez ensuite les sections avec un milieu de montage approprié et scellez chaque glissement de couverture avec du vernis à ongles clair. Des sections de tissu sont examinées pour la présence des lésions blanches de matière et les régions choisies sont souillées pour l’activité immunisée et la démyélinisation. Dans les lésions multiples aiguës de Sceloris beaucoup de ces axones démyélinisés agissent comme ampoules de rétractation axonales qui reflètent les extrémités proximales des axones transected.
La densité des axones transected dans les lésions aiguës dépasse 11000 par millimètre cube dans les lésions actives comparées à seulement 15 dans les régions adjacentes non lesional de matière blanche. Les oligodendrocytes nouvellement générés sont également présents dans beaucoup de lésions chroniques de SEP. Ces processus s’associent aux axones démyélisés myélinates, mais ne le font pas.
Une recherche représentative et impartiale des changements neuronaux de gène dans cortext moteur rapidement congelé obtenu des patients chroniques de SEP, a identifié des réductions significatives dans 23 études nucléaires et codées de messager mitochondrique d’ARN credentialing utilisant l’immunocytochimie et l’hybridation in situ ont indiqué que ces gènes ont été fortement enrichis dans les neurones corticals de projection et que les mitochondries isolées des axones de projection affichent la glycolyse réduite. La comparaison de l’expression du gène neuronode dans l’hippocampe myéliné et démyéliné révèle des réductions de l’ARN messager neuronal, y compris les protéines impliquées dans la mémoire et l’apprentissage. De plus, comparativement aux cortices de contrôle, la perte neuronale corticale est significativement plus grande dans une sous-population de patients atteints de SP qui ont démyélinisation de la moelle épinière et du cortex cérébral, mais pas de la matière blanche cérébrale.
Pendant le traitement des tissus, assurez-vous que lorsque les sections coronale sont coupées, elles sont coupées uniformément en ce qui concerne l’épaisseur et l’orientation. Et qu’ils se trouvent à plat lorsqu’ils flottent dans un fixatif ou lorsqu’ils sont gelés. En plus de l’analyse immunohistochimique, la collecte des tissus congelés nous donne l’occasion de mener une analyse génétique et protéomique.
Ces techniques ont aidé à l’identification d’une nouvelle cohorte de patients atteints de SP présentant des lésions cérébrales de matière blanche à l’IRM, mais sans démyélinisation significative de la matière blanche. Appelé Myelocortical MS.
