Целью наших исследований является изучение патогенеза рассеянного склероза. Для достижения этой цели мы создали программу быстрого вскрытия для получения и изучения мозга у людей с MS. Есть два специальных аспекта нашей программы вскрытия, во-первых, это быстро. Мы собираем мозг в возрасте от шести до восьми часов после смерти.
Это позволяет проводить самые художественные молекулярные исследования. Второй аспект заключается в том, что мы делаем МРТ на месте, прежде чем двигать мозг. Это позволяет нам соотносить патологические изменения с изменениями визуализации мозга.
Визуальная демонстрация позволяет зрителям понять, как мы организуем наше пространство и время для достижения оптимальных результатов. Обработка тканей, которая происходит быстро и тщательно позволяет для анализа РНК, иммуностимуляторов, иммуноблотинг и МРТ корреляции. Новые исследователи могут бороться с обработкой тканей с плохой целостностью тканей.
Как избежать долгого времени посмертной фиксации имеет важное значение и МРТ ткани корде полосы может быть сложной задачей, поэтому консультации с ЭКСПЕРТами МРТ анализ может быть очень полезным. Демонстрацией процедуры будут Эмили Кристи и Кристина Вольско. Техники из нашей лаборатории.
После магнитно-резонансной томографии на месте взвесить и сфотографировать мозг и поместить любой прикрепленный дура в контейнер 4%Paraformaldehyde или PFA. Отделяем мозжечок и ствол мозга от головного мозга и фотографируем мозг. Используйте зонд, чтобы отделить зрительные нервы, чиазмы и тракты и переутомить структуру скальпелем.
Отделите полушария головного мозга продольно и фотографируют каждое полушарие по отдельности. Чернила первичной моторной коры или PMC для левого полушария, перефотограф ткани и место ткани в 3,3 литровый контейнер для длительной фиксации. Для акциза PMC для правого полушария удалить покрытие околивания и перефотограф ткани.
Далее переутомляйте PMC с помощью скальпеля. Затем сфотографируемый PMC рядом с полушарием. Разрежьте PMC на шесть секций одинакового размера и потравьте ростральный аспект каждого раздела.
Затем поместите каждый второй раздел в заполненные PFA контейнеры для короткой фиксации. И оснастки заморозить оставшиеся разделы для хранения в запечатанных морозильных мешках, в холодильнике номер один. Вырежьте переднее правое полушарие до заднего на один сантиметр толщиной корональных секций.
Исправить все другие разделы в PFA и оснастки заморозить оставшиеся разделы для хранения в запечатанных морозильных мешках, в кулер номер один. Отделяем ствол мозга от мозжечка и поместите ствол мозга в заполненный PFA контейнер для короткой фиксации. Разрежьте каждое мозжечковое полушарие на четыре одинаково фиксированных сагиттаальных секции и сфотографируют медиальные и боковой виды.
Затем поместите левые мозжечковые ломтики полушария в контейнер PFA для короткой фиксации. И оснастки заморозить право мозжечковых срезов полушария для хранения в запечатанных морозильных мешках, в кулер номер один. После получения спинного мозга с нервными корнями удалить спинной мозг dura mater и хранить дуру в PFA.
Отделите левые и правые передние и задние нервные корни и отрежьте левые передние и задние нервные корни от спинного мозга для короткой фиксации в PFA. Вырезать право передние и задние нервные корни из спинного аккорда и оснастки заморозить эти ткани для хранения в запечатанных морозильной камере мешки, в кулер номер два. Затем сфотографируем хвостовой части спинного мозга на 20 сантиметров и перережьте два сантиметра секций передачи от каудала до рострального направления шнура для короткой фиксации PFA и замораживания оснастки.
Затем сфотографируют оставшуюся рострльную часть спинного мозга. И вырезать два сантиметра передачи разделов от каудала до рострального направления шнура для короткой фиксации PFA и оснастки замораживания. Вырезать разделы интереса от коротких или длинных фиксированных тканей.
Поместите секции в отдельные колодцы из шести хорошо пластины и мыть ткани с тремя пять минут моет в два миллилитров свежего PBS за стирку, с тряской. Для поиска антигена, микроволновой печи разделов в течение двух-трех минут в стакане, содержащий примерно 30 миллилитров 10 миллимоллар цитрат буфера. Когда секции остыли до комнатной температуры передачи образцов в новые шесть пластин хорошо в течение трех пяти минут моет и два миллилитров PBS, плюс 0,3%Triton X-100 за колодец, за стирку.
Затем эндогенная пероксидная блокировка в двух миллилитров 3%перекиси водорода плюс 0,3%Triton X-100 в PBS в течение 30 минут, при комнатной температуре. В конце инкубации, мыть разделы три раза в два миллилитров PBS плюс Тритон X-100 за стирку, как попродемонстрировано. Затем блокирование в двух миллилитров 3%нормальной сыворотки козы и PBS плюс Тритон X-100 в течение одного часа при комнатной температуре.
Далее, инкубировать разделы от ночи до пяти дней в первичных антител, представляющих интерес при четырех градусах по Цельсию, а затем три пять минут моет в двух миллилитров PBS за стирку. Инкубировать секции в avidin-биотин комплексный раствор или ABC комплекс в течение одного часа, при комнатной температуре. Следите за этим с тремя пять минут моет в PBS.
Этикетка разделов с двумя миллилитров фильтрованного Diaminobenzidine дополняется перекисью водорода на колодец в течение трех-восьми минут. Когда цвет адекватно разработан, мыть разделы три раза в PBS и индивидуально передать каждый раздел в PBS заполнены контейнера. Распоить каждую секцию на ровном месте, под отдельными слайдами тканей.
И аккуратно поднимите каждый слайд из PBS, сохраняя разделы как можно более плоским. Используйте две кисти, чтобы аккуратно сгладить и растянуть каждую ткань. И использовать бумажное полотенце, чтобы мазок от избытка воды.
Затем смонтировать секции с соответствующей крепления среды и печать каждой крышки скольжения с четким лаком для ногтей. Ткань разделы рассматриваются на наличие поражений белого вещества и выбранных регионах окрашены для иммунной активности и демиелинизации. При острых множественных поражениях Sceloris многие из этих демиелинированных аксонов действуют как аксональные опровержения луковиц, которые отражают проксимальные концы трансектированных аксонов.
Плотность трансектных аксонов при острых поражениях превышает 11000 на кубический миллиметр при активных поражениях по сравнению с 15 в соседних неимплиентных областях белого вещества. Недавно созданные олигодендроциты также присутствуют во многих хронических поражениях MS. Эти процессы ассоциируются с, но не myelinate демиелинатных аксонов.
Представитель, непредвзятый поиск нейрональных изменений генов в быстро замороженных моторных коры, полученных от хронических пациентов MS, определены значительные сокращения в 23 ядерных и закодированных митохондриальных посланников РНК учетных исследований с использованием иммуноцитохимии и на месте гибридизации показали, что эти гены были высоко обогащены корковых нейронов проекции и что митохондрии изолированы от проекционных аксонов дисплей снижение гликолиза. Сравнение экспрессии генов нейронодов в миелинированных и демиелинированных гиппокампе показывает снижение нейрональной РНК посыльного, включая белки, участвующие в памяти и обучении. Кроме того, по сравнению с контрольных кортиков, корковой нейрональной потери значительно больше в суб популяции пациентов MS, которые демиелинизации спинного мозга и коры головного мозга, но не головного белого вещества.
Во время обработки тканей, убедитесь, что при разрезе корональных секций они последовательно вырезать по отношению к толщине и ориентации. И что они лежат плашмя, когда плавают в фиксаторе или при заморозке. Помимо иммуногистохимического анализа, сбор замороженных тканей дает нам возможность провести генетический и протеомный анализ.
Эти методы помогли в выявлении новой когорты пациентов MS с повреждениями головного мозга белого вещества на МРТ, но без каких-либо значительных демиелинизации белого вещества. Термин миелокортикальный MS.
