L'obiettivo della nostra ricerca è studiare la patogenesi della sclerosi multipla. Per raggiungere questo obiettivo abbiamo stabilito un programma di autopsia rapida per ottenere e studiare il cervello da individui con SM. Ci sono due aspetti speciali del nostro programma di autopsia, il primo è che è rapido. Raccogliamo che il cervello ha meno di sei-otto ore di morte.
Ciò consente studi molecolari all'avanguardia. Il secondo aspetto è che facciamo una risonanza in situ prima di muovere il cervello. Questo ci permette di correlare i cambiamenti patologici con i cambiamenti dell'imaging cerebrale.
La dimostrazione visiva consente agli spettatori di capire come organizziamo il nostro spazio e il nostro tempo per ottenere risultati ottimali. L'elaborazione tissutale che avviene rapidamente e con attenzione consente l'analisi dell'RNA, l'immunosottenimento, l'immunoblotting e le correlazioni mri. I nuovi ricercatori possono lottare con la lavorazione dei tessuti con scarsa integrità tissutale.
Evitare lunghi tempi di fissazione post mortem è importante e le corde dei tessuti MRI possono essere impegnative, quindi la consultazione con gli esperti di analisi della risonanza prima della valutazione può essere molto utile. A dimostrare la procedura saranno Emilie Christie e Christina Volsko. Tecnici del nostro laboratorio.
Dopo la risonanza magnetica in situ, pesare e fotografare il cervello e posizionare qualsiasi dura attaccata in un contenitore del 4%Paraformaldeide o PFA. Separare il cervelletto e il tronco encefalico dal cerebro e fotografare il cerebro. Utilizzare una sonda per separare i nervi ottici, il chiasmo e le vie e resect la struttura con un bisturi.
Separare gli emisferi cerebrali longitudinalmente e fotografare ogni emisfero singolarmente. Inchiostrare la corteccia motoria primaria o pmc per l'emisfero sinistro, rifotografare il tessuto e posizionare il tessuto in un contenitore da 3,3 litri per una lunga fissazione. Per asportare il PMC per l'emisfero destro rimuovere le meningi di copertura e rifotografare il tessuto.
Quindi resect il PMC usando un bisturi. Quindi fotografare il PMC reinsediato vicino all'emisfero. Tagliare il PMC in sei sezioni di dimensioni uguali e inchiostrare l'aspetto rostrale di ogni sezione.
Quindi posizionare ogni altra sezione in contenitori riempiti di PFA per una breve fissazione. E agganciare congelare le sezioni rimanenti per la conservazione in sacchetti congelatori sigillati, in frigo numero uno. Tagliare l'emisfero destro anteriore a posteriore in sezioni coronali spesse un centimetro.
Fissare ogni altra sezione in PFA e congelare le sezioni rimanenti per la conservazione in sacchetti congelatori sigillati, nel dispositivo di raffreddamento numero uno. Separare il tronco encefalico dal cervelletto e posizionare il tronco encefalico in un contenitore riempito di PFA per una breve fissazione. Tagliare ogni emisfero cerebellare in quattro sezioni sagittali ugualmente fisse e fotografare le viste mediali e laterali.
Quindi posizionare le fette emisferiche cerebellari sinistra in un contenitore di PFA per una breve fissazione. E schioccare congelare le fette emisferiche cerebellari giuste per la conservazione in sacchetti congelatori sigillati, in refrigeratore numero uno. Dopo aver ottenuto il midollo spinale con le radici nervose rimuovere il midollo spinale dura mater e conservare la dura in PFA.
Separare le radici del nervo anteriore e posteriore sinistro e destro e tagliare le radici nervose anteriori e posteriori sinistra dal midollo spinale per una breve fissazione in PFA. Tagliare le radici nervose anteriori e posteriori destra dalla corda spinale e congelare questi tessuti per la conservazione in sacchetti congelatori sigillati, in refrigeratore numero due. Quindi fotografare il caudale-massimo 20 centimetri del midollo spinale e tagliare sezioni di trasferimento di due centimetri dalla direzione caudale a quella rostrale del cordone per la fissazione breve pfa e il congelamento a scatto.
Quindi fotografare la porzione rostrale rimanente del midollo spinale. E tagliare sezioni di trasferimento di due centimetri dalla direzione caudale a quella rostrale del cavo per la fissazione breve della PFA e il congelamento a scatto. Tagliare sezioni di interesse dai tessuti fissi corti o lunghi.
Posizionare le sezioni in singoli pozzi di un piatto di sei pozzetti e lavare i tessuti con tre lavaggi di cinque minuti in due millilitri di PBS fresco per lavaggio, con scuotimento. Per il recupero dell'antigene, microonde le sezioni per due o tre minuti in un bicchiere contenente circa 30 millilitri di tampone di citrato millimollare. Quando le sezioni si sono raffreddate a temperatura ambiente trasferire i campioni in una nuova piastra a sei pozzetti per tre lavaggi di cinque minuti e due millilitri di PBS, più 0,3%Triton X-100 per pozzo, per lavaggio.
Seguito da blocco endogeno della perossidasi in due millilitri di perossido di idrogeno del 3% più 0,3%Tritone X-100 in PBS per 30 minuti, a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, lavare le sezioni tre volte in due millilitri di PBS più Triton X-100 per lavaggio, come dimostrato. Seguito dal blocco in due millilitri di siero di capra normale al 3% e PBS più Triton X-100 per un'ora a temperatura ambiente.
Successivamente, incubare le sezioni dalla notte a cinque giorni negli anticorpi primari di interesse a quattro gradi celsius seguiti da tre lavaggi di cinque minuti in due millilitri di PBS per lavaggio. Incubare le sezioni in soluzione complessa di avidina-biotina o complesso ABC per un'ora, a temperatura ambiente. Segui questo con tre lavaggi di cinque minuti in PBS.
Etichettare le sezioni con due millilitri di Diaminobenzidina filtrata integrata con perossido di idrogeno per pozzo per tre o otto minuti. Quando il colore si è sviluppato adeguatamente, lavare le sezioni tre volte in PBS e trasferire singolarmente ogni sezione in un contenitore riempito di PBS. Posizionare ogni sezione in modo piatto, sotto singoli scivoli tissutali.
E sollevare delicatamente ogni scivolo dal PBS, mantenendo le sezioni il più piatte possibile. Utilizzare due pennelli per appiattire delicatamente e allungare ogni tessuto. E usa un tovagliolo di carta per tamponare l'acqua in eccesso.
Quindi montare le sezioni con un mezzo di montaggio appropriato e sigillare ogni coperchio scivolare con smalto chiaro. Le sezioni tissutali vengono esaminate per la presenza di lesioni da materia bianca e le regioni selezionate sono macchiate per l'attività immunitaria e la deyelinazione. Nelle lesioni acute di Sceloris multipli molti di questi assoni demieliniati agiscono come bulbi di retrazione assonale che riflettono le estremità prossimali degli assoni traslitti.
La densità degli assoni transetti nelle lesioni acute supera i 11000 millimetri cubi nelle lesioni attive rispetto a soli 15 nelle regioni adiacenti di materia bianca non lesionale. Gli oligodendrociti appena generati sono presenti anche in molte lesioni croniche della SM. Questi processi si associano ma non mielitano gli assoni demielininati.
Una ricerca rappresentativa e imparziale dei cambiamenti del gene neuronale nel cortext motorio rapidamente congelato ottenuto da pazienti affetti da SM cronici, ha identificato riduzioni significative in 23 studi di credenziali del messaggero mitocondriale nucleare e codificato utilizzando l'immunocitochimica e l'ibridazione in situ ha indicato che questi geni erano altamente arricchiti nei neuroni di proiezione corticale e che i mitocondri isolati dagli assoni di proiezione mostrano una glicolisi ridotta. Il confronto dell'espressione genica neuronodica negli ippocampi mielinati e demielinizzati rivela riduzioni degli RNA messaggero neuronali, comprese le proteine coinvolte nella memoria e nell'apprendimento. Inoltre, rispetto alle cortici di controllo, la perdita neuronale corticale è significativamente maggiore in una sottostima di pazienti affetti da SM che hanno demielinazione del midollo spinale e cortext cerebrale ma non della materia bianca cerebrale.
Durante la lavorazione dei tessuti, assicurarsi che quando le sezioni coronali vengono tagliate vengono tagliate in modo coerente rispetto allo spessore e all'orientamento. E che giacciono piatti quando galleggiano in un fissatore o quando congelati. Oltre all'analisi immunoistochimica, la raccolta dei tessuti congelati ci offre l'opportunità di condurre analisi genetiche e proteomiche.
Queste tecniche hanno aiutato nell'identificazione di una nuova coorte di pazienti affetti da SM con lesioni cerebrali da materia bianca sulla risonanza ma senza alcuna deyelinizzazione significativa della materia bianca. Definito MS mielocorticale.
