El objetivo de nuestra investigación es estudiar la patogénesis de la esclerosis múltiple. Para lograr este objetivo hemos establecido un programa rápido de autopsia para obtener y estudiar el cerebro de individuos con MS. Hay dos aspectos especiales de nuestro programa de autopsias, el primero es que es rápido. Recogemos el cerebro por debajo de seis a ocho horas de muerte.
Esto permite estudios moleculares de última generación. El segundo aspecto es que hacemos una resonancia magnética in situ antes de mover el cerebro. Esto nos permite correlacionar los cambios patológicos con los cambios en las imágenes cerebrales.
La demostración visual permite a los espectadores comprender cómo organizamos nuestro espacio y tiempo para lograr resultados óptimos. El procesamiento de tejido que se produce rápidamente y cuidadosamente permite el análisis de ARN, inmunosu manchado, inmunoblotting y correlaciones de RMN. Los nuevos investigadores pueden tener problemas con el procesamiento de tejidos con mala integridad tisular.
Evitar largos tiempos de fijación post mortem es importante y las estrías de corde tisular por RMN pueden ser difíciles, por lo que consultar con expertos en análisis de RMN puede ser muy útil. Demostrando el procedimiento serán Emilie Christie y Christina Volsko. Técnicos de nuestro laboratorio.
Después de la resonancia magnética in situ, pese y fotografíe el cerebro y coloque cualquier dura adjunta en un recipiente de 4%Paraformaldehído o PFA. Separe el cerebelo y el tronco encefálica del cerebro y fotografíe el cerebro. Utilice una sonda para separar los nervios ópticos, el quiasmo y las vías y resecar la estructura con un bisturí.
Separe los hemisferios cerebrales longitudinalmente y fotografíe cada hemisferio individualmente. Tinta la corteza motora primaria o PMC para el hemisferio izquierdo, refotografo el tejido y colocar el tejido en un recipiente de 3,3 litros para una fijación larga. Para extirpar el PMC para el hemisferio derecho retire las meninges de recubrimiento y vuelva afotografía del tejido.
A continuación, resecar el PMC usando un bisturí. A continuación, fotografíe el PMC resecado junto al hemisferio. Corte el PMC en seis secciones de igual tamaño y tinta el aspecto rostral de cada sección.
A continuación, coloque cada otra sección en recipientes llenos de PFA para una fijación corta. Y enganche las secciones restantes para almacenar en bolsas de congelador selladas, en el refrigerador número uno. Corte el hemisferio derecho anterior a posterior en secciones coronales de un centímetro de espesor.
Fije cada otra sección en PFA y congele las secciones restantes para almacenar en bolsas de congelador selladas, en el refrigerador número uno. Separe el tronco encefálica del cerebelo y coloque el tronco encefálica en un recipiente lleno de PFA para una fijación corta. Corte cada hemisferio cerebeloso en cuatro secciones sagitales igualmente fijas y fotografíe las vistas medial y lateral.
A continuación, coloque las rodajas hemisféricas cerebelosas izquierdas en un recipiente de PFA para una fijación corta. Y congelar las rebanadas hemisféricas cerebelosas correctas para almacenarlas en bolsas de congelador selladas, en el refrigerador número uno. Después de obtener la médula espinal con las raíces nerviosas eliminar la médula espinal dura mater y almacenar la dura en PFA.
Separe las raíces nerviosas anteriores y posteriores izquierda y derecha y corte las raíces nerviosas anterior y posterior izquierda de la médula espinal para una fijación corta en PFA. Cortar las raíces nerviosas anteriores y posteriores correctas de la cuerda vertebral y congelar estos tejidos para almacenarlos en bolsas de congelador selladas, en el refrigerador número dos. A continuación, fotografie los 20 centímetros de la médula espinal y corte dos secciones de transferencia de centímetros desde el caudal hasta la dirección rostral del cordón para la fijación corta PFA y congelación a presión.
Luego fotografíe la porción rostral restante de la médula espinal. Y corte las secciones de transferencia de dos centímetros de la dirección caudal a rostral del cordón para la fijación corta PFA y congelación de presión. Corte las secciones de interés de los tejidos fijos cortos o largos.
Coloque las secciones en pozos individuales de una placa de seis pozos y lave los tejidos con tres lavados de cinco minutos en dos mililitros de PBS fresco por lavado, con agitación. Para la recuperación de antígenos, microonda las secciones durante dos a tres minutos en un vaso de precipitados de vidrio que contiene aproximadamente 30 mililitros de 10 tampón de citrato milimolar. Cuando las secciones se hayan enfriado a temperatura ambiente, transfiera las muestras a una nueva placa de seis pozos para tres lavados de cinco minutos y dos mililitros de PBS, más 0.3%Triton X-100 por pozo, por lavado.
Seguido por el bloqueo endógeno de peroxidasa en dos mililitros de 3%peróxido de hidrógeno más 0.3%Tritón X-100 en PBS durante 30 minutos, a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave las secciones tres veces en dos mililitros de PBS más Tritón X-100 por lavado, como se ha demostrado. Seguido por el bloqueo en dos mililitros de 3% de suero de cabra normal y PBS más Triton X-100 durante una hora a temperatura ambiente.
A continuación, incubar las secciones de la noche a cinco días en los anticuerpos primarios de interés a cuatro grados centígrados seguidos de tres lavados de cinco minutos en dos mililitros de PBS por lavado. Incubar las secciones en solución compleja de avidina-biotina o complejo ABC durante una hora, a temperatura ambiente. Siga esto con tres lavados de cinco minutos en PBS.
Etiquetar las secciones con dos mililitros de Diaminobenzidina filtrada suplementada con peróxido de hidrógeno per pozo por pozo durante tres a ocho minutos. Cuando el color se haya desarrollado adecuadamente, lave las secciones tres veces en PBS y transfiera individualmente cada sección a un recipiente lleno de PBS. Coloque cada sección planamente, debajo de diapositivas de tejido individuales.
Y levante suavemente cada diapositiva fuera del PBS, manteniendo las secciones lo más planas posible. Use dos pinceles para aplanar y estirar suavemente cada tejido. Y usa una toalla de papel para eliminar el exceso de agua.
A continuación, monte las secciones con un medio de montaje adecuado y selle cada resbalón de cubierta con esmalte de uñas transparente. Las secciones de tejido se examinan en busca de la presencia de lesiones de materia blanca y las regiones seleccionadas se tiñen de actividad inmune y desmielinización. En lesiones agudas múltiples de Sceloris muchos de estos axones desmielinados actúan como bulbos de retracción axonal que reflejan los extremos proximales de los axones transectados.
La densidad de los axones transectados en lesiones agudas supera los 11000 por milímetro cúbico en lesiones activas en comparación con sólo 15 en regiones adyacentes de materia blanca no lesional. Los oligodendrocitos recién generados también están presentes en muchas lesiones crónicas de la E.S. Estos procesos se asocian con los axones desmielinados pero no mielinados.
Una búsqueda representativa e imparcial de cambios en los genes neuronales en el cortexto motorizado rápidamente congelado obtenidos de pacientes con EME crónica, identificó reducciones significativas en 23 estudios de credencialización del ARN del mensajero mitocondrial nuclear y codificado mediante inmunocitoquímica e hibridación in situ indicaron que estos genes estaban altamente enriquecidos en las neuronas de proyección cortical y que las mitocondrias aisladas de los proyecciones de axinos muestran una glucólisis reducida. La comparación de la expresión génica del neuronodo en hipocampos mielinados y desmielinados revela reducciones en el ARN mensajero neuronal, incluidas las proteínas implicadas en la memoria y el aprendizaje. Además, en comparación con los cortices de control, la pérdida neuronal cortical es significativamente mayor en una subcuestorula de pacientes con EME que tienen desmielinización de la médula espinal y cortexto cerebral, pero no de la materia blanca cerebral.
Durante el procesamiento del tejido, asegúrese de que cuando se cortan las secciones coronales se cortan de manera consistente con respecto al grosor y la orientación. Y que se encuentran planas cuando flotan en un fijador o cuando se congelan. Además del análisis inmunohistoquímico, la colección de tejidos congelados nos brinda la oportunidad de realizar análisis genéticos y proteómicos.
Estas técnicas han ayudado en la identificación de una nueva cohorte de pacientes con AMA con lesiones de materia blanca cerebral en la RMN, pero sin ninguna desmielinización significativa de la materia blanca. Denominado MS mielocortical.
