Name: isolation of atrial myocytes from adult mice
Uploaded: 2019-07-25T14:00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice at JoVE.com

ويدعم هذا العمل منح تشغيلية من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (MOP 93718, 142486) ومؤسسة القلب والسكتة الدماغية الكندية إلى R.A. Rose.  ه. ج. جانسن هو حاصل على زمالة كيلام ما بعد الدكتوراه.

وقد وافقت لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة كالغاري على جميع الإجراءات الحيوانية، وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية للمجلس الكندي لرعاية الحيوانات. تم الحصول على عزل الخلايا الاستئصالية الأذينية والصور والنتائج التمثيلية الموضحة أدناه من فأر ة من النوع البري C57Bl/6 ذكر يبلغ من العمر 15 أسبوعًا. نستخدم هذا البروتوكول بشكل روتيني لعزل الخلايا المائة الأذينية من الفئران من النوع البري17و18والفئران التي تحمل طفرات جينية19و20 ونماذج الماوس من الأمراض مثل ارتفاع ضغط الدم المزمن6 ، 14. ويمكن استخدام البروتوكول بالمثل للفئران الذكور أو الإناث. كما استعنا نسخة مماثلة من إجراء العزل هذا لعزل العقدة السنوية للخلايا من قلب الماوس17،21،22،23. يوجد مخطط انسيابي لهذا البروتوكول التجريبي في الشكل 1.
1. إعداد حلول المخزون والمعدات
<ol><li>إعداد 1 طبق تشريح عن طريق إضافة الاستومر سيليكون وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. إضافة ما يكفي من مركب الاستومر سيليكون لتغطية الجزء السفلي من طبق بيتري 10 سم إلى عمق 1 سم. ملاحظة: يمكن إعادة استخدام هذا الطبق تشريح السيليكون لعدة أشهر وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>إعداد 3 ماصات باستور مصقولة بالنار مع فتحة 1 ملم (تتحمل صغيرة)، 3 ملم (تتحمل المتوسطة)، أو 5 ملم (تتحمل كبيرة) في القطر كما هو مبين في الشكل 2A. لجعل هذه الماصات، ويسجل ماصة باستور ومن ثم المفاجئة على طول علامة النتيجة لإنتاج فتحة أكبر قليلا من حجم تتحمل المطلوب. استخدام ملف معدني لتنعيم السطح ومن ثم تلميع النار هذا الافتتاح باستخدام لهب مفتوح. ملاحظة: وهذا سوف تنتج على نحو سلس، والنار مصقول الحافة مع فتحة من القطر المطلوب. من المهم أن يكون الافتتاح خالياً من الشقوق والأسطح الخشنة. ويمكن تخزين هذه الماصات المصقولة بالنار في درجة حرارة الغرفة وإعادة استخدامها لعدة أشهر.</li>
	<li>إعداد حلول الأسهم لحل Tyrode pH 6.9 وحل Tyrode pH 7.4 كما هو موضح في الجدول 1. أيضا إعداد 10 مل كل من1 M MgCl 2, 1 M CaCl2,و 100 mM CaCl2. استخدم الماء النقي للغاية لجميع الحلول واخزنه عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهرين.</li>
	<li>إعداد 1 لتر من حل Kraft-Brühe المعدل (KB) كما هو مبين في الجدول 2. استخدام المياه فائقة النقاء. تقسيم الحل إلى aliquots 20 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر.</li>
</ol>2. إعداد الحلول وإعداد العزل لعزل الخلايا الاستئصالية الأذينية
<ol><li>إعداد 50 مل من حل PH 7.4 المعدلة Tyrode كما هو موضح في الجدول 3 في قارورة Erlenmeyer 125 مل، وذلك باستخدام 1 M CaCl2 و 1 M MgCl2 حلول الأسهم. ضع قارورة Erlenmeyer في حمام مائي 35 درجة مئوية حتى الاستخدام، كما هو موضح في الشكل 2B.</li>
	<li>إعداد الحل المعدل ة PH 6.9 Tyrode كما هو موضح في الجدول 4 في أنبوب 50 مل، وذلك باستخدام 100 مل CaCl2 الأوراق المالية الحل. Aliquot 2.5 مل من هذا الحل في كل من ثلاثة أنابيب أسفل جولة 5 مل. ضع هذه الأنابيب في رف سلك يوضع في حمام مائي بزاوية 35 درجة مئوية حتى يتم استخدامه، كما هو موضح في الشكل 2B.</li>
	<li>إعداد محلول الإنزيم كما هو موضح في الجدول 5 في أنبوب أسفل جولة 14 مل. لجعل محلول البروتياز، إضافة 1 ملغ من البروتياز لكل 100 درجة مئوية من المياه فائقة النقاء. ضع الأنبوب الذي يحتوي على هذا الأنزيم في رف الأسلاك واحتضنه في حمام مائي بزاوية 35 درجة مئوية حتى يتم استخدامه.</li>
	<li>إذابة واحدة aliquot من حل KB المعدلة في حمام المياه 35 درجة مئوية. Aliquot 2.5 مل من حل كيلو بايت في كل من ثلاثة أنابيب أسفل جولة 5 مل و 2.5 مل في أنبوب أسفل جولة 14 مل. ضع هذه الأنابيب في رف الأسلاك وحضانة في حمام مائي 35 درجة مئوية حتى الاستخدام، كما هو مبين في الشكل 2B.</li>
	<li>وضع لوحة تشريح، وأدوات تشريح، ماصة باستور، والماصات المصقولة بالنار كما هو مبين في الشكل 2B.</li>
</ol>3. تشريح الإلحاق الأذيني الماوس
<ol><li>حقن الماوس مع 0.2 مل من الهيبارين (10 000 USP U/10 مل) عن طريق الحقن داخل الشبكية والانتظار 5 دقائق للامتصاص.</li>
	<li>وضع الماوس في غرفة التعريفي والتخدير عن طريق استنشاق isoflurane (3-4٪). يتم تسليم الإيسوفيلوران والأكسجين باستخدام آلة مخدرة ويتم مسح النفايات الغاز مخدر. مرة واحدة يتم التخدير الماوس، ولا يظهر رد فعل قرصة اصبع القدم، قتل الماوس عن طريق خلع عنق الرحم السريع. وضع الماوس على منشفة ورقية أو لوحة الفلين والشريط الكفوف وصولا الى عقد الماوس في المكان.</li>
	<li>بلل صدر الفأر مع الإيثانول 70٪. إزالة الفراء والجلد التي تغطي الصدر باستخدام مقص منحني. بعد ذلك، استخدم ملقط أسنان الفئران لرفع القص ثم قطع الحجاب الحاجز على طول حافة الأضلاع. إزالة القفص الصدري بأكمله باستخدام مقص منحني لفضح القلب.</li>
	<li>لإزالة الزائدة الأذينية (يمين أو يسار)، قم برفع الزائدة بلطف باستخدام ملقط تشريح غرامة وقطعها مع مقص الربيع. نقل على الفور الزائدة الأذينية إلى طبق تشريح المغلفة سيليكون تحتوي على 20 مل من الحل المعدلة درجة الحموضة 7.4 في Tyrode الدافئة الموصوفة في الخطوة 2.1.</li>
	<li>وضع دبوس تشريح واحد في الجزء العلوي ودبوس واحد في الجزء السفلي من افتتاح الزائدة الأذينية. باستخدام ماصة المراعي، اغسل الأذينين بمحلول TyH 7.4 المعدل الدافئ لإزالة الدم. فتح الزائدة الأذينية عن طريق قطع على طول الحافة العليا والسفلية من الزائدة الأذيني. بعد ذلك، دبوس زوايا الزائدة الأذينية وصولا الى خلق شقة، قطعة مستطيلة من الأنسجة، كما هو مبين في الشكل 3A.</li>
</ol>4. عزل الخلايا الماية الأذينية
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات في هذا القسم عند 35 درجة مئوية، مع أنابيب مغمورة في حمام مائي 35 درجة مئوية. كن حذرا عند نقل شرائط الأنسجة بين أنابيب القاع جولة لضمان أن يتم نقل الأنسجة فقط (وليس الحل) بين الأنابيب.
<ol><li>قطع الزائدة الأذينية إلى ما يقرب من 8-10 شرائط متساوية الحجم (حوالي 0.7 ملم في العرض) باستخدام مقص الربيع وملقط غرامة. يظهر مثال على شرائط الأنسجة الأذينية في الشكل 3B. لاحظ أن الشرائط العقد بمجرد قطعها خالية من قطعة رئيسية من الأنسجة. باستخدام ماصة صغيرة ملمعة بالنار، نقل شرائط الأنسجة إلى الأنبوب الأول الذي يحتوي على الحل المعدلة الدافئة Tyrode درجة الحموضة 6.9 الموصوفة في الخطوة 2.2. انتظر 5 دقائق.</li>
	<li>غسل شرائط الأنسجة عن طريق نقلها إلى الثانية ثم أنبوب أسفل الجولة الثالثة التي تحتوي على تعديل حل درجة الحموضة 6.9 Tyrode أعدت في الخطوة 2.2 باستخدام ماصة متوسطة تحمل النار مصقول.<ol>
<li>لغسل شرائط الأنسجة، قم بغطاء الأنبوب السفلي الدائري بـ 5 مل وعكس الأنبوب برفق 3 مرات. السماح شرائط الأنسجة تسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب قبل نقل شرائط الأنسجة إلى الأنبوب التالي باستخدام ماصة متوسطة تحمل النار مصقول.</li>
	</ol>
</li>
	<li>نقل شرائط الأنسجة في محلول الإنزيم الموضح في الخطوة 2.3 باستخدام ماصة متوسطة ملمعة بالنار وحضانة لمدة 30 دقيقة. ملاحظة: في بداية الهضم الأنزيمي ، تستقر شرائط الأنسجة بسرعة بعد الدوران. في حوالي 20 دقيقة من الهضم، تبدأ شرائط الأنسجة في الطفو في الحل الأنزيمي بعد الدوامة. خلال هذا الوقت، شرائط الأنسجة الأذينية تتغير أيضا في المظهر من الوردي الشاحب إلى الأبيض كما يتم هضمها.</li>
	<li>بعد الهضم الأنزيمي، قم بإجراء ثلاث عمليات تجميع باستخدام 2.5 مل من محلول كيلو بايت في أنابيب القاع الدائرية 5 مل المعدة في الخطوة 2.4. لكل غسل، عكس بلطف الأنبوب 3 مرات قبل نقل الأنسجة إلى الأنبوب التالي باستخدام ماصة متوسطة ملمعة بالنار. بعد الغسيل النهائي، نقل شرائط في أنبوب أسفل جولة 14 مل تحتوي على 2.5 مل من محلول كيلو بايت. انتظر 5 دقائق.</li>
	<li>تُطوّر الأنسجة بلطف لمدة 7.5 دقيقة باستخدام ماصة مُلمعة بالنار. وهذا سوف ينفصل ميكانيكيا شرائط الأنسجة وتسفر عن حل غائم مليئة الخلايا المائع الأذينية الفردية. ملاحظة: أثناء التتطر، يصبح النسيج أبيض ويصبح الحل غائمًا. وينبغي أن تكون قوة التتقوى، التي تتحقق عن طريق تغيير تواتر وسرعة طرد شرائط الأنسجة من الماصة الواسعة المصقولة بالنار، مصممة خصيصاً للعزلة الفردية. إذا كان التتطر لطيف جداً، فإن العائد الخلوي سيكون منخفضاً، في حين أن التتطر الذي هو قاس جداً سوف تسفر عن العديد من الخلايا الميتة. تجنب فقاعات في حين triturating.</li>
	<li>ملء أنبوب أسفل جولة 14 مل تحتوي على شرائط الأنسجة triturated مع حل كيلو بايت إلى حجم نهائي من 7-10 مل اعتمادا على الكثافة المطلوبة من الخلايا للاستخدام التجريبي. ضع هذا الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. بعد فترة الحضانة هذه، يمكن استخدام الخلايا لمجموعة متنوعة من التجارب لمدة تصل إلى 7 ح. ويمكن أيضا تخزين الخلايا في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 7 ساعة.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bartos, D. C., Grandi, E., Ripplinger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Channels+in+the+Heart.">Ion Channels in the Heart.</a> Comprehensive Physiology. 5 (3), 1423-1464 (2015).</li><li>Heijman, J., Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+electrophysiology+of+atrial+fibrillation+initiation,+maintenance,+and+progression.">Cellular and molecular electrophysiology of atrial fibrillation initiation, maintenance, and progression.</a> Circulation Research. 114 (9), 1483-1499 (2014).</li><li>Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+persistent+atrial+fibrillation.">Mechanisms of persistent atrial fibrillation.</a> Current Opinion in Cardiology. 29 (1), 20-27 (2014).</li><li>Nattel, S., Maguy, A., Le Bouter, S., Yeh, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrhythmogenic+ion-channel+remodeling+in+the+heart:+heart+failure,+myocardial+infarction,+and+atrial+fibrillation.">Arrhythmogenic ion-channel remodeling in the heart: heart failure, myocardial infarction, and atrial fibrillation.</a> Physiological Reviews. 87 (2), 425-456 (2007).</li><li>Jansen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrial+structure,+function+and+arrhythmogenesis+in+aged+and+frail+mice.">Atrial structure, function and arrhythmogenesis in aged and frail mice.</a> Scientific Reports. 7, 44336 (2017).</li><li>Jansen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+patterns+of+atrial+electrical+and+structural+remodeling+in+angiotensin+II+mediated+atrial+fibrillation.">Distinct patterns of atrial electrical and structural remodeling in angiotensin II mediated atrial fibrillation.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 124, 12-25 (2018).</li><li>Nerbonne, J. M., Kass, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+physiology+of+cardiac+repolarization.">Molecular physiology of cardiac repolarization.</a> Physiological Reviews. 85 (4), 1205-1253 (2005).</li><li>Grant, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+ion+channels.">Cardiac ion channels.</a> Circulalation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).</li><li>Schmitt, N., Grunnet, M., Olesen, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+potassium+channel+subtypes:+new+roles+in+repolarization+and+arrhythmia.">Cardiac potassium channel subtypes: new roles in repolarization and arrhythmia.</a> Physiological Reviews. 94 (2), 609-653 (2014).</li><li>Lomax, A. E., Kondo, C. S., Giles, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+time-+and+voltage-dependent+K++currents+in+myocytes+from+left+and+right+atria+of+adult+mice.">Comparison of time- and voltage-dependent K+ currents in myocytes from left and right atria of adult mice.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 285 (5), H1837-H1848 (2003).</li><li>Li, D., Zhang, L., Kneller, J., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+ionic+mechanism+for+repolarization+differences+between+canine+right+and+left+atrium.">Potential ionic mechanism for repolarization differences between canine right and left atrium.</a> Circ Res. 88 (11), 1168-1175 (2001).</li><li>Wirth, K. J., Knobloch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+dofetilide,+amiodarone,+and+class+lc+drugs+on+left+and+right+atrial+refractoriness+and+left+atrial+vulnerability+in+pigs.">Differential effects of dofetilide, amiodarone, and class lc drugs on left and right atrial refractoriness and left atrial vulnerability in pigs.</a> Naunyn Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 363 (2), 166-174 (2001).</li><li>Qi, A., Yeung-Lai-Wah, J. A., Xiao, J., Kerr, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+differences+in+rabbit+atrial+repolarization:+importance+of+transient+outward+current.">Regional differences in rabbit atrial repolarization: importance of transient outward current.</a> American Journal of Physiology. 266 (2 Pt 2), H643-H649 (1994).</li><li>Jansen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPR-C+(Natriuretic+Peptide+Receptor-C)+Modulates+the+Progression+of+Angiotensin+II-Mediated+Atrial+Fibrillation+and+Atrial+Remodeling+in+Mice.">NPR-C (Natriuretic Peptide Receptor-C) Modulates the Progression of Angiotensin II-Mediated Atrial Fibrillation and Atrial Remodeling in Mice.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 12 (1), e006863 (2019).</li><li>Mangoni, M. E., Nargeot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+regulation+of+the+heart+automaticity.">Genesis and regulation of the heart automaticity.</a> Physiological Reviews. 88 (3), 919-982 (2008).</li><li>Voigt, N., Pearman, C. M., Dobrev, D., Dibb, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+isolating+atrial+cells+from+large+mammals+and+humans.">Methods for isolating atrial cells from large mammals and humans.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 86, 187-198 (2015).</li><li>Springer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natriuretic+peptides+BNP+and+CNP+increase+heart+rate+and+electrical+conduction+by+stimulating+ionic+currents+in+the+sinoatrial+node+and+atrial+myocardium+following+activation+of+guanylyl+cyclase-linked+natriuretic+peptide+receptors.">The natriuretic peptides BNP and CNP increase heart rate and electrical conduction by stimulating ionic currents in the sinoatrial node and atrial myocardium following activation of guanylyl cyclase-linked natriuretic peptide receptors.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (5), 1122-1134 (2012).</li><li>Hua, R., Adamczyk, A., Robbins, C., Ray, G., Rose, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+patterns+of+constitutive+phosphodiesterase+activity+in+mouse+sinoatrial+node+and+atrial+myocardium.">Distinct patterns of constitutive phosphodiesterase activity in mouse sinoatrial node and atrial myocardium.</a> PLoS One. 7 (10), e47652 (2012).</li><li>Egom, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+sinoatrial+node+function+and+increased+susceptibility+to+atrial+fibrillation+in+mice+lacking+natriuretic+peptide+receptor+C.">Impaired sinoatrial node function and increased susceptibility to atrial fibrillation in mice lacking natriuretic peptide receptor C.</a> Journal of Physiology. 593 (5), 1127-1146 (2015).</li><li>Hua, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Wild-Type+and+Mutant+Forms+of+Atrial+Natriuretic+Peptide+on+Atrial+Electrophysiology+and+Arrhythmogenesis.">Effects of Wild-Type and Mutant Forms of Atrial Natriuretic Peptide on Atrial Electrophysiology and Arrhythmogenesis.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 8 (5), 1240-1254 (2015).</li><li>Krishnaswamy, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+parasympathetic+nervous+system+regulation+of+the+sinoatrial+node+in+Akita+diabetic+mice.">Altered parasympathetic nervous system regulation of the sinoatrial node in Akita diabetic mice.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 82, 125-135 (2015).</li><li>Mackasey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natriuretic+peptide+receptor+C+(NPR-C)+protects+against+angiotensin+II+mediated+sinoatrial+disease+in+mice.">Natriuretic peptide receptor C (NPR-C) protects against angiotensin II mediated sinoatrial disease in mice.</a> JACC Basic to Translational Science. , (2018).</li><li>Azer, J., Hua, R., Vella, K., Rose, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natriuretic+peptides+regulate+heart+rate+and+sinoatrial+node+function+by+activating+multiple+natriuretic+peptide+receptors.">Natriuretic peptides regulate heart rate and sinoatrial node function by activating multiple natriuretic peptide receptors.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 53 (5), 715-724 (2012).</li></ol>

ولا يتعين على أصحاب البلاغ أن يكشفوا عن أي شيء.

يستخدم مختبرنا هذا البروتوكول بشكل روتيني لعزل الخلايا العضلية الأذينية للماوس لاستخدامها في تجارب التصحيح المشبك من أجل التحقيق في آثار أشكال مختلفة من أمراض القلب والأوعية الدموية، والطفرات الوراثية، أو المركبات الدوائية على الخلايا العضلية الأذينية الفيزيولوجيا الكهربائية. على الرغم من أن استنساخ للغاية، ونوعية البيانات التي تم الحصول عليها من myocytes الأذيني المعزول يعتمد على نوعية العزلة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن إعادة إدخال الكالسيوم بعد عزل الخلايا الأذينية سيؤدي إلى موت الخلايا لسكان الخلايا المعزولة بسبب مفارقة الكالسيوم16. وبناء على ذلك، فإن عزل الخلايا الاستئصالية القابلة للبقاء والجودة العالية باستخدام هذا النهج يتطلب الممارسة والتحسين في نقاط متعددة في جميع أنحاء العزلة. مرة واحدة الأمثل، ويقدر أن ما بين 70-90٪ من مجموع الخلايا المابية الأذينية المعزولة باستخدام هذا النهج سوف تكون على حد سواء الكالسيوم على شكل قضيب. وترد أدناه مناقشة للخطوات التي تتطلب أقصى قدر من الممارسة والتحسين.
سرعة وكفاءة تشريح سيكون لها آثار المصب على نوعية الخلايا المعزولة. من المهم أن تأخذ بعض الوقت لضمان إزالة جميع الدم من الأنسجة الأذينية وأن يتم قطع شرائط الأنسجة إلى حجم مماثل. وينبغي أن يستغرق ما يقرب من 5 دقائق لإزالة الزائدة الأذينية، وقطع الأنسجة إلى شرائح، ونقل شرائط الأنسجة في الأنبوب الأول من الحل المعدل ة درجة الحموضة 6.9 تايرود. ومع ذلك، إذا كانت هذه الخطوة تستغرق وقتاً طويلاً جداً، قد تتعرض نوعية الأنسجة للخطر.
من المهم أيضا أن يتم قطع شرائط الأنسجة إلى حجم موحد داخل العزلة وبين القلوب. إذا كانت شرائط الأنسجة كبيرة جداً أو صغيرة جداً، أو إذا لم تكن موحدة داخل العزلة، وهذا يمكن أن يسبب مشاكل أثناء كل من الهضم الأنزيمي وtrituration. وذلك لأن شرائط صغيرة سوف تكون أكثر دقة هضمها وشرائط كبيرة سوف تكون تحت هضمها. من المهم بنفس القدر النظر في النمط الجيني والإعداد المرض التي تجري دراستها كما يمكن أن يختلف حجم الزائدة الأذينية بين الحيوانات. على سبيل المثال، القلوب الضخامية لديها الزوائد الأذينية أكبر مقارنة مع قلوب صحية، وبالتالي يمكن للمجرّب قطع المزيد من الشرائط في القلوب الضخامية مقارنة بقلوب الحجم الطبيعي. وبناء على ذلك، فإن تحسين حجم شرائط الأنسجة المقطوعة وتطبيق هذه الأبعاد على كل ملحق الأذيني الفردي ة سيحسن إلى حد كبير من إمكانية استنساخ انعزال الخلايا العضلية بين الظروف التجريبية.
التوازن الدقيق بين الهضم الأنزيمي والتفكك الميكانيكي هو المفتاح لعزل الخلايا الاستئصالية الأذينية الناجحة باستخدام هذا البروتوكول. إذا لم يتم تدوير الأنسجة بشكل كاف خلال الهضم الأنزيمي شرائط الأنسجة الفردية سوف تميل إلى تكتل والعصا معا، والتي سوف تحد من فعالية الهضم الأنزيمي. إذا كان المهتاج في كثير من الأحيان أو بقوة، وهذا يمكن أن تضر الأنسجة الأذينية، والتي سوف تؤدي إلى عزل الخلايا غير القابلة للحياة. التفكك الميكانيكي للخلايا اللاترية المعزولة من شرائط الأنسجة أثناء التطرّف هو الخطوة الأكثر أهمية لممارسة وتحسين استخدام هذا النهج لعزل الخلايا العضلية الأذينية. إذا كان التتطر لطيف جداً، فإن عائد الخلايا سيكون منخفضاً. من ناحية أخرى، إذا كان التتثثير قاسية جدا، ثم سيتم عزل وفرة من الخلايا العضلية غير قابلة للحياة، ونوعية البيانات التي تم الحصول عليها خلال تجارب التصحيح المشبك سوف تتعرض للخطر. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤثر تكوين الأذينين على العزلة. على سبيل المثال، إذا كانت الأنسجة ليفية، قد تحتاج إلى تعديل الهضم الأنزيمي وخطوات التقرحات. ولذلك من المهم أن تأخذ من الوقت لتطوير المهارات اللازمة للحصول على خلايا ذات جودة عالية أثناء trituration التي يمكن استخدامها لتجارب التصحيح المشبك.
كما هو الحال مع جميع التقنيات التجريبية هناك قيود. هذه التقنية تتطلب الممارسة من أجل عزل reproducibly قابلة للحياة، والخلايا العضلية ذات جودة عالية، والتي بدورها سوف تؤثر على جدوى أي تجارب التي يتعين إجراؤها باستخدام هذه الخلايا العضلية. هذا النهج هو أيضا الطرفية والخلايا الاستئصالية الأذينية معزولة باستخدام هذا النهج يمكن استخدامها في يوم العزلة فقط. يستخدم مختبرنا الخلايا ضمن 6-7 ساعة من العزلة.
هذا النهج من عزل خلايا القلب الأذينية لديها العديد من التطبيقات. على سبيل المثال، يمكن تعديل هذا النهج لعزل الخلايا العضلية الأذينية (وكذلك الخلايا الليفية القلبية) عن الأنواع الأخرى بما في ذلك الخزعات الأنسجة الأذينية البشرية. وبالإضافة إلى ذلك، فائدة لاستخدام هذه الطريقة قطعة لعزل الخلايا الاستئصالية الأذينية (على النقيض من التسريب الرجعي للقلب) هو أنه يمكن تعديلها لعزل خلايا القلب من مناطق أخرى من القلب، مثل العقدة سينوتريل أو مناطق محددة أخرى من عضلة القلب الأذيني، أو تشمل المنطقة فوق البطينية بأكملها من القلب. يستخدم مختبرنا خلايا القلب الأذينية لتجارب التصحيح المشبك لقياس إمكانات العمل والتيارات الأيونية، على الرغم من أن هذا النهج لا ينبغي أن يقتصر على هذه التقنية. على سبيل المثال، يمكن استخدام الخلايا العضلية المعزولة للتحقيق في التعديلات في عابري الكالسيوم والانقباض في مجموعة متنوعة من الإعدادات التجريبية. كما يمكن استخدام خلايا القلب الأذينية في دراسات الفلورة المناعية لدراسة موقع البروتينات أو الهياكل ذات الأهمية. وبناء على ذلك، فإن هذا النهج متعدد الاستخدامات للغاية مع العديد من التطبيقات الممكنة.

الأتريا، والتي هي رقيقة الجدران، وغرف الضغط المنخفض من القلب التي تتلقى الدم من الوريد الأجوف متفوقة وأدنى، فضلا عن الأوردة الرئوية، هي جزء لا يتجزأ من علم وظائف الأعضاء القلبية العادية. مثل مناطق أخرى من القلب، تحتوي الأذينين على عدد من أنواع الخلايا، بما في ذلك خلايا القلب، والخلايا الليفية، والخلايا البطانية، وخلايا العضلات الملساء الوعائية، وغيرها. الخلايا العضلية الأذينية هي الخلايا المنفعلة كهربائيا التي تلعب دورا أساسيا في إجراء الإشارات الكهربائية من خلال القلب، وبالتالي ضمان تقلص الأذيني السليم خلال كل قلب ينبض1. الخلل الكهربائي في الأذين يمكن أن يؤدي إلى عدد من عدم انتظام ضربات القلب الأذيني محددة مثل رفرفة الأذيني والرجفان الأذيني2،3. وهذه المعدلات منتشرة إلى حد كبير، وإن كانت غير مفهومة بشكل جيد، وتؤدي إلى حدوث اعتلال ووفيات كبيرين. يمكن أن يحدث الرجفان الأذيني بالاقتران مع الطفرات الوراثية، بالاشتراك مع الشيخوخة أو فيوضع الأشكال المكتسبة من أمراض القلب، بما في ذلك ارتفاع ضغط الدم، وفشل القلب والسكري 2،4،5 ،6. هذه الشروط يمكن أن تغير الخصائص الكهربائية للخلايا العضلية الأذينية التي يمكن أن تخلق الركيزة التي تزيد من انتشار عدم انتظام ضربات القلب1،2.
الوظيفة الكهربائية العادية في الأذينين، فضلا عن عدم انتظام ضربات القلب الأذيني، تتأثر بشكل كبير من قبل مورفولوجيا إمكانية العمل (AP) المنتجة في الخلايا العضلية الأذينية. يتم إنشاء AP الأذيني من نشاط عدد من التيارات الأيونية، بمافي ذلك تيار الصوديوم (I Na، التي تحملها قنوات NaV1.5)، وتيار الكالسيوم من نوع L (ICa,L، التي يحملها Cav1.2 و CaV1.3 القنوات )، والعديد من تيارات البوتاسيوم بما في ذلك تيار البوتاسيوم المعدل المتأخر فائق السرعة (IKur، الذي يحمله KV1.5 القنوات)، وتيار البوتاسيوم الخارجي العابر (Ito، الذي يحمله KV4.2 و KV4.3 القنوات)، وثبات حالة تيار البوتاسيوم (IKss،التي تحملها KV2.1 قنوات)، وتيار البوتاسيوم المعدل الداخلي (IK1،التي تحملها K الأشعةتحت الحمراء2.1 قنوات)1،7، 8. على الرغم من أنها لا تلعب دورا رئيسيا في الأذين الماوس، والمكونات السريعة والبطيئة من المعدل تأخر K+ الحالي (أناKr وIKs) تسهم أيضا في إعادة استقطاب AP في بعض الأنواع7. التعديلات في واحد أو أكثر من هذه التيارات الأيونية يمكن أن تغير بشكل كبير الخصائص الكهربائية للخلايا العضلية الأذينية، والتي يمكن أن تؤدي إلى عدم انتظام ضربات القلب الأذيني. على سبيل المثال، يمكن أن يؤدي انخفاض في INa إلى إبطاء سرعة التوصيل عبر الأذينين عن طريق تقليل سرعة ضغط الضربات الشديدة AP. من ناحية أخرى، يمكن أن يؤدي انخفاض في إعادة استقطاب تيارات البوتاسيوم أو زيادة في إما أناCa، L أو فيوقت متأخر أناNa في تطوير الاستقطابات afterdeالتي يمكن أن تؤدي إلى نشاط عفوي في الأذين1، 2,9.
من المهم أن ندرك أن هناك اختلافات في مورفولوجيا AP في أجزاء مختلفة من عضلة القلب الأذيني التي من المرجح أن تكون بسبب الاختلافات في التعبير أو تنظيم هذه القنوات أيون الكامنة. على سبيل المثال، تم وصف الاختلافات في مدة AP بين الأذينين الأيمن والأيسر بالاقتران مع الاختلافات في الأولإلى الكثافة الحالية بشكل جيد10،11،12،13. أيضا، لقد أثبتنا مؤخرا أن هناك أنماط متميزة من إعادة عرض الكهربائية في الأذين الأيمن والأيسر من الفئران مع ارتفاع ضغط الدم المزمن6،14. الجدار الخلفي الأذيني الحق يحتوي أيضا على عقدة سينوتريل، التي لديها أنماط متميزة خاصة بها من مورفولوجيا AP وأنماط اطلاقالنار 15. يمكن التحقيق في الخصائص المميزة للخلايا العضلية في كل من هذه الأجزاء المختلفة من الأذينين بالتفصيل باستخدام الخلايا العضلية المعزولة من كل من هذه المناطق.
هناك طرق مختلفة التي يمكن استخدامها لعزل الخلايا العضلية الأذينية لدراسات الفيزيولوجيا الكهربائية التصحيح المشبك16. أحد الاحتمالات هو استخدام نهج التسريب الرجعي حيث يتم تعليب القلب عن طريق الأبهر لتسليم الإنزيمات. في حين أن هذا هو نهج قابل للتطبيق، فإنه يمكن أن تنتج تقلب في نوعية الخلايا العضلية الأذينية بسبب عدم الاتساق في التسريب من الأذينين. لقد اعتمدنا نهج الهضم "قطعة" لعزل الخلايا العضلية الأذينية التي تقضي على الحاجة إلى التسريب الرجعي للقلب. نهجنا يستخدم مزيج من الهضم الأنزيمي والتفكك الميكانيكي للأنسجة الأذينية التي تنتج باستمرار وموثوق بها أعداد كبيرة من الخلايا العضلية الأذينية المعزولة التي هي مناسبة لدراسات التصحيح المشبك. في حين أننا نصف نهجنا هنا باستخدام أنسجة الزائدة الأذينية، يمكن استخدام النهج على أي منطقة من عضلة القلب الأذينية (أي، الزوائد الأذينية اليمنى أو اليسرى، والجدران الحرة، والجدران الخلفية) التي يختارها المحقق. هذا النهج مثالي لدراسات الفيزيولوجيا الكهربائية للخلايا الأتريلفية في الفئران المعدلة وراثيا،في نماذج الماوس من أمراض القلب والأوعية الدموية، أو لدراسة آثار المركبات الدوائية 5،6،17 , 18 سنة , 19.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1, 2-Bis(2-Aminophenoxy)ethane-N, N, N&#39;, N&#39;-tetraacetic acid 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4926-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra, &#62; 99%, from microbial</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate magnesium salt &#62; 95%, bacterial</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphocetericin B from Streptomyces sp. ~80% (HPLC), powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4888-500 MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3059-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride ReagentPlus, 99.9%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>289329-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium hydroxide monohydrate &#62; 99.5% trace metals basis</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>562505-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 2</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine anhydrous</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Aspartic acid potassium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2025-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase suspension</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS002279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid &#62;97.0%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate &#62; 95% (HPLC), powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin 10 000 USP units/10mL</td>
			<td>SANDOZ</td>
			<td>10750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES &#62; 99.5% (titration)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate &#62; 99% (HPLC), powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine &#62; 98% (HPLC), powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7634-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine disodium salt hydrate enzymatic, approx 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7936-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride ACS reagent, 99.0-100.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>EM Science</td>
			<td>PX1480-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>EMD</td>
			<td>PX1565-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease from Streptomyces griseus, type XIV, &#62;3.5 units/mg solid, powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5147-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride ACS reagent, &#62; 99.0%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide, pellets, 97+%, A.C.S. reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221465-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>World Precision Instruments Inc</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraethylammonium chloride &#62; 98% (titration)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2265-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of atrial myocytes from adult mice

الخصائص الكهرولوجية للخلايا الاستئصالية الأذينية تؤثر بشكل مهم على وظيفة القلب عموما. يمكن أن تسبب التعديلات في التيارات الأيونية الكامنة المسؤولة عن إمكانية العمل ركائز موالة لاضطراب عدم انتظام ضربات القلب التي تكمن وراء عدم انتظام ضربات القلب، مثل الرجفان الأذيني، والتي تنتشر بشكل كبير في العديد من الحالات وحالات المرض. عزل الخلايا القلبية الأذينية الماوس الكبار لاستخدامها في تجارب التصحيح المشبك قد عززت إلى حد كبير معرفتنا وفهم الفيزيولوجيا الكهربائية الخلوية في عضلة القلب الأذيني صحية وفي وضع الفيزيولوجيا المرضية الأذينية. وبالإضافة إلى ذلك، أوضحت الدراسات التي تستخدم نماذج الماوس الوراثية دور مجموعة واسعة من البروتينات في تنظيم الفيزيولوجيا الكهربائية الأذينية. هنا نقدم بروتوكول مفصل لعزل خلايا القلب من الزوائد الأذينية للفئران البالغة باستخدام مزيج من الهضم الأنزيمي والتفكك الميكانيكي لهذه الأنسجة. هذا النهج ينتج باستمرار وموثوق بها خلايا القلب الأذينية المعزولة التي يمكن استخدامها بعد ذلك لتوصيف الفيزيولوجيا الكهربائية الخلوية عن طريق قياس إمكانات العمل والتيارات الأيونية في تجارب التصحيح المشبك تحت عدد من التجريبية الظروف.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice at JoVE.com

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

يتم استخدام هذا البروتوكول لعزل خلايا القلب الأذينية واحدة من قلب الماوس الكبار باستخدام نهج هضم قطعة. يتم استخدام هذا النهج لعزل الخلايا العضلية الأذينية اليمنى أو اليسرى التي يمكن استخدامها لوصف الفيزيولوجيا الكهربائية للخلايا العضلية الأذينية في دراسات التصحيح المشبك.

عزل الخلايا الماية الأذينية من الفئران البالغة

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

عزل myocytes الأذينية لاستخدامها في التجارب التصحيح المشبك قد تقدمت إلى حد كبير معرفتنا وفهم الجزيئات الأذينية في كل من المستويين الخلوي والجزيئي. النهج الذي نستخدمه يؤدي بشكل فعال إلى أعداد كبيرة من الخلايا الأذينية المعزولة التي يمكن استخدامها للتحقيق في علم الفيزيولوجيا الكهربائية الأذينية الخلوية وتولد عدم انتظام الإصابة في مجموعة واسعة من النماذج والظروف التجريبية. لقد اعتمدنا نهج الهضم الجذع لعزل myocytes الأذينية.وميزة هذا النهج هي أنه يسمح للباحث باختيار المنطقة المحددة التي يرغب في التحقيق فيها. ابدأ هذا الإجراء بإعداد المعدات والحلول كما هو موضح في بروتوكول النص. وضع لوحة تشريح، تشريح الأدوات، ماصة باستور، والماصات النار مصقول.يمكن تنفيذ هذا البروتوكول على الفئران من النوع البري ذكر أو أنثى، الفئران التي تحمل الطفرات الوراثية، ونماذج الماوس من المرض. بعد القتل الرحيم الماوس كما هو موضح في بروتوكول النص، ضع الماوس على منشفة ورقية أو لوحة فلينة وشريط الكفوف إلى أسفل لعقد الماوس في مكان. الرطب في صدر الماوس مع 70٪ الإيثانول.إزالة الفراء والجلد الذي يغطي الصدر باستخدام مقص منحني. المقبل استخدام الجرذ ملقط الأسنان لرفع القص ومن ثم قطع الحجاب الحاجز على طول حافة الأضلاع. إزالة القفص الصدري بأكمله باستخدام مقص منحني لفضح القلب.لإزالة الملحق الأذيني، رفع بلطف الملحق باستخدام ملقط تشريح غرامة وقطع بها مع مقص الربيع. نقل على الفور الملحق الأذيني إلى طبق تشريح مغلفة السيليكون تحتوي على 20 ملليلتر من محلول تايرود المعدلة درجة حرارة 7.4. ضع دبوسًا واحدًا في الأعلى ودبوسًا واحدًا في أسفل فتح الزوائد الأذينية.باستخدام ماصة باستور، قم بمسح الأذين مع محلول تايرود المعدلة 7.4 لإزالة الدم. فتح الملحق الأذيني عن طريق قطع على طول على حافة أعلى وأسفل. المقبل، دبوس زوايا الملحق الأذيني وصولا الى خلق قطعة مستطيلة مسطحة من الأنسجة.قطع الزوائد الأذينية إلى ما يقرب من ثمانية إلى 10 شرائط متساوية الحجم باستخدام مقص الربيع والملقط غرامة. لاحظ أن الشرائط العقد مرة واحدة يتم قطع خالية من قطعة رئيسية من الأنسجة. باستخدام ماصة صغيرة مشتعلة النار مصقول، نقل شرائح الأنسجة في أنبوب الأول الذي يحتوي على حرارة معدلة حل تيرود 6.9 درجة حُر.انتظر خمس دقائق الآن، استخدام متوسطة تحمل النار الماصات المصقولة لنقل شرائط الأنسجة إلى أنبوب أسفل الجولة الثانية التي تحتوي على تعديل حل تايرود درجة ص ف 6.9. لغسل شرائط الأنسجة، قبعة أنبوب سفلي جولة خمسة ملليلتر وعكس بلطف الأنبوب ثلاث مرات.اسمحوا شرائط الأنسجة تسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب قبل نقل شرائط الأنسجة إلى أنبوب ثالث باستخدام المتوسطة النار تحمل الماصات المصقولة. غسل الشرائط مرة أخرى عن طريق عكس. ثم, نقل شرائط الأنسجة في محلول الانزيم باستخدام المتوسطة النار المواص المصقولة واحتضان لمدة 30 دقيقة.دوامة الأنبوب كل ثلاث إلى خمس دقائق لمنع شرائط الأنسجة من التمسك معا. في بداية الهضم الأنزيمي ، تستقر شرائط الأنسجة بسرعة بعد الدوران. في حوالي 20 دقيقة من الهضم ، تبدأ شرائط الأنسجة في الطفو في محلول الأنزيمي بعد الدوران.خلال هذا الوقت، وشرائط الأنسجة الأذينية أيضا تغيير في المظهر من الوردي الشاحب إلى الأبيض كما يتم هضمها. بعد الهضم الأنزيمي، قم بإجراء ثلاثة غسلات باستخدام 2.5 ملليلتر من محلول كيلوبايت في أنابيب القاع المستديرة الخمسة المُعدة. لكل غسل، عكس بلطف الأنبوب ثلاث مرات قبل نقل الأنسجة إلى الأنبوب التالي باستخدام متوسطة تحمل ماصة مصقول النار.بعد الغسيل النهائي، قم بنقل الشرائط إلى أنبوب 14 ملليلتر مستدير القاع يحتوي على 2.5 ملليلتر من حل كيلوبايت. انتظر خمس دقائق ثلاثية بلطف الأنسجة لمدة 7.5 دقائق باستخدام ماصة النار واسعة تتحمل مصقول.هذا سوف تفكيك ميكانيكيا شرائط الأنسجة وأسفرت عن حل غائم مليئة myocytes الأذينية الفردية. يجب أن تكون مصممة الأولى من التثاب لتسفر عن عدد كبير من الخلايا دون تلف الخلايا. النظر في عوامل مثل عمر الفئران وحالة المرض.تخصيص قوة التثاقل لعزلة الفرد عن طريق تغيير كل من التردد والسرعة لطرد شرائط الأنسجة من على نطاق واسع النار المصاة المصقولة. نتائج التثاقل اللطيف في انخفاض غلة الخلية ، في حين أن التثاقل القاسي سوف ينتج العديد من الخلايا الميتة. ملء 14 ملليلتر جولة أنبوب القاع التي تحتوي على شرائط الأنسجة ثلاثية الترور مع حل كيلوبايت إلى حجم النهائي من سبعة إلى 10 ملليلتر اعتمادا على الكثافة المطلوبة من الخلايا للاستخدام التجريبي.ضع هذا الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد فترة الحضانة هذه، يمكن استخدام الخلايا لمجموعة متنوعة من التجارب لمدة تصل إلى سبع ساعات. تظهر هنا أمثلة على الخلايا الأذينية المعزولة من الفئران العادية.يتم عادةً على ترتيب 100 ميكرون في الطول و 10 ميكرون في العرض مع التصدعات واضحة. السعة من myocytes الأذينية المعزولة عادة 40 إلى 70 picofarads. مثال على احتمالية إجراء myocyte الأذينية المسجلة باستخدام تقنية مثقبة التصحيح المشبك في وضع المشبك الحالي.تم تسجيل عائلة تمثيلية من تيارات الصوديوم في تكوين الخلية بأكملها من تقنية التصحيح المشبك. تم تسجيل هذه التيارات باستخدام 50 ملي ثانية الجهد المشبك الخطوات بين السلبية 100 والإيجابية 10 millivolts من احتمال عقد من 120 ملليفولت سالبة. ويرد ملخص الصوديوم الحالي العلاقة الجهد هنا.تم تسجيل عائلة تمثيلية من تيارات الكالسيوم باستخدام 250 ملي ثانية خطوات المشبك الجهد بين السلبية 60 والإيجابية 80 millivolts من احتمال عقد 70 ملليفولت سالبة. يتم عرض ملخص الكالسيوم الحالي العلاقة الجهد هنا. تم تسجيل عائلة تمثيلية من تيارات البوتاسيوم من احتمال عقد 80 ميليفولت سالب باستخدام 500 ميلي ثانية الجهد المشبك الخطوات بين السلبية 120 millivolts و 80 ملليفولت إيجابية.هنا يظهر ملخص العلاقة التيار الجهد لمجموع البوتاسيوم الحالية. من المهم أن نتذكر أن عزل الأذيني الأذيني الناجح يعتمد على كل من الهضم الأنزيمي المناسب وكذلك الانفصال الميكانيكي للخلايا أثناء التثاب. مرة واحدة معزولة، myocytes الأذينية يمكن استخدامها في التجارب التصحيح المشبك لقياسات العمل المورفولوجيا المحتملة والتيارات الأيونية، مثل التيارات الصوديوم، التيارات الكالسيوم، والتيارات البوتاسيوم.وكان التحقيق في التغيرات في الفيزيولوجيا الكهربائية الأذينية ضرورية لتحديد الأساس الخلوي والجزيئي لاضطران نظم الأذينية التي تهدد الحياة، ولتطوير واختبار المركبات المضادة للاضطران لعدم انتظام ضربات القلب.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

عزلة الإنسان الفشوت من المرضى مستأصل البنكرياس جزئيا

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

The WATCHMAN Left Atrial Appendage Closure Device for Atrial Fibrillation

بقي الحارس الأذيني سيلة إغلاق لاحقة لالرجفان الأذيني

Atrial fibrillation (AF) is the most common cardiac arrhythmia, affecting an estimated 6 million people in the United States 1. Since AF affects primarily ...

Catheter Ablation in Combination With Left Atrial Appendage Closure for Atrial Fibrillation

اجتثاث القثطرة في تركيبة مع الزمن لاختتام أطرافهم الأذيني الرجفان الأذيني

Atrial fibrillation (AF) is the most common sustained cardiac arrhythmia, affecting millions of individuals worldwide 1-3. The rapid, irregular, and ...

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

زرع النخاع الشوكي زجاج نوافذ في الفئران الكبار مع التهاب الدماغ التجريبية المناعة الذاتية

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

Robotic Ablation of Atrial Fibrillation

الروبوتية تذرية من الرجفان الأذيني

Background: Pulmonary vein isolation (PVI) is an established treatment for atrial fibrillation (AF). During PVI an electrical conduction block between ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

عزل وزراعة كارديوميوسيتيس الفئران الكبار

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

عزل كارديوميوسيتيس خوارج من نموذج الفئران من فشل القلب المتصلة بالمتلازمة الأيضية مع كسر قذفي الحفاظ على

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

بالموجات فوق الصوتية زيادة الابتدائية الكبار العزلة الليفية

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

Echocardiographic Evaluation of Atrial Communications before Transcatheter Closure

التقييم صدى القلب للاتصالات الأذينية قبل إغلاق عبر القسطر

Transthoracic (TTE) and transesophageal echocardiography (TEE) is the standard imaging method for atrial septal defect (ASD) and patent foramen ovale ...

Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice

تعديلات على طريقة Langendorff لعزل المتزامنة من الخلايا العضلية الأذيني والبطيني من الفئران الكبار

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction ...