Name: ubiquitous and tissue-specific rna targeting in drosophila melanogaster using crispr/casrx
Uploaded: 2021-02-05T15:00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل جزئيا بتمويل من منحة برنامج الجينات الآمنة DARPA (HR0011-17-2-0047)، وجوائز المعاهد القومية للصحة (R21RAI149161A، DP2AI152071) الممنوحة لشركة O.S.A.

<ol>
	<li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nat Communications. 9, 1911 (2018).</li><li>Abudayyeh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C2c2+is+a+single-component+programmable+RNA-guided+RNA-targeting+CRISPR+effector.">C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.</a> Science. 353 (6299), 5573 (2016).</li><li>East-Seletsky, A., O'Connell, M., Burstein, D., Knott, G., Doudna, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Targeting+by+Functionally+Orthogonal+Type+VI-A+CRISPR-Cas+Enzymes.">RNA Targeting by Functionally Orthogonal Type VI-A CRISPR-Cas Enzymes.</a> Molecular Cell. 66 (3), 373-383 (2017).</li><li>Konermann, S., Lotfy, P., Brideau, N., Oki, J., Shokhirev, M., Hsu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+Engineering+with+RNA-Targeting+Type+VI-D+CRISPR+Effectors.">Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors.</a> Cell. 173 (3), 665-676 (2018).</li><li>Buchman, A., Brogan, D., Sun, R., Yang, T., Hsu, P., Akbari, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+RNA+Targeting+Using+CasRx+in+Flies.">Programmable RNA Targeting Using CasRx in Flies.</a> The CRISPR Journal. 3 (3), 164-176 (2020).</li><li>Kushawah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas13d+Induces+Efficient+mRNA+Knockdown+in+Animal+Embryos.">CRISPR-Cas13d Induces Efficient mRNA Knockdown in Animal Embryos.</a> Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).</li><li>Abudayyeh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+targeting+with+CRISPR-Cas13.">RNA targeting with CRISPR-Cas13.</a> Nature. 550, 280-284 (2017).</li><li>Perrimon, N., Ni, J., Perkins, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+RNAi:+today+and+tomorrow.">In vivo RNAi: today and tomorrow.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 003640 (2010).</li><li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila.">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-156 (2007).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+resource+of+transgenic+RNAi+lines+for+neurogenetics.">A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics.</a> Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+shRNA+resource+for+transgenic+RNAi+in+Drosophila.">A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila.</a> Nature Methods. 8, 405-407 (2011).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+and+parameters+for+targeted+transgenic+RNA+interference+in+Drosophila+melanogaster.">Vector and parameters for targeted transgenic RNA interference in Drosophila melanogaster.</a> Nature Methods. 5, 49-51 (2008).</li><li>Heigwer, F., Port, F., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+(RNAi)+Screening+in+Drosophila.">RNA Interference (RNAi) Screening in Drosophila.</a> Genetics. 208 (3), 853-874 (2018).</li><li>Kulkarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+off-target+effects+associated+with+long+dsRNAs+in+Drosophila+melanogaster+cell-based+assays.">Evidence of off-target effects associated with long dsRNAs in Drosophila melanogaster cell-based assays.</a> Nature Methods. 3, 833-838 (2006).</li><li>Ma, Y., Creanga, A., Lum, L., Beachy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+off-target+effects+in+Drosophila+RNA+interference+screens.">Prevalence of off-target effects in Drosophila RNA interference screens.</a> Nature. 443, 359-363 (2006).</li><li>Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matter+arising:+off-targets+and+genome-scale+RNAi+screens+in+Drosophila.">Matter arising: off-targets and genome-scale RNAi screens in Drosophila.</a> Fly. 1 (1), 1-5 (2007).</li><li>Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+position+effects+and+the+gypsy+retrovirus+insulator+to+engineer+precisely+expressed+transgenes.">Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes.</a> Nature Genetics. 40, 476-483 (2008).</li><li>Champer, J., Buchman, A., Akbari, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cheating+evolution:+engineering+gene+drives+to+manipulate+the+fate+of+wild+populations.">Cheating evolution: engineering gene drives to manipulate the fate of wild populations.</a> Nature Review Genetics. 17 (3), 146-159 (2016).</li><li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+dengue+neutralization+in+mosquitoes+expressing+an+engineered+antibody.">Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody.</a> PLoS Pathogens. 16 (4), 1008103 (2020).</li><li>Mathur, G., Sanchez-Vargas, I., Alvarez, D., Olson, K., Marinotti, O., James, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgene-mediated+suppression+of+dengue+viruses+in+the+salivary+glands+of+the+yellow+fever+mosquito,+Aedes+aegypti.">Transgene-mediated suppression of dengue viruses in the salivary glands of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> Insect Molecular Biology. 19 (6), 753-763 (2011).</li><li>Franz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+RNA+interference-based+resistance+to+dengue+virus+type+2+in+genetically+modified+Aedes+aegypti.">Engineering RNA interference-based resistance to dengue virus type 2 in genetically modified Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4198-4203 (2006).</li><li>Yen, P., James, A., Li, J., Chen, C., Failloux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+miRNAs+induce+dual+arboviral-resistance+phenotypes+in+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti.">Synthetic miRNAs induce dual arboviral-resistance phenotypes in the vector mosquito Aedes aegypti.</a> Communications Biology. 1, 11 (2018).</li><li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+resistance+to+Zika+virus+in+transgenic+Aedes+aegypti+expressing+a+polycistronic+cluster+of+synthetic+small+RNAs.">Engineered resistance to Zika virus in transgenic Aedes aegypti expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).</li><li>. Addgene Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/restriction-digest/">https://www.addgene.org/protocols/restriction-digest/</a> (2020)</li><li>Gibson, D., Young, L., Chuang, R., Venter, J., Hutchison, C., Smith, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>. Addgene Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/pcr/">https://www.addgene.org/protocols/pcr/</a> (2020)</li><li>. Indiana University Bloomington Available from: <a target="_blank" href="https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.htmL">https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.htmL</a> (2020)</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR:ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Jiang, W., Brueggeman, A., Horken, K., Plucinak, T., Weeks, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+transient+expression+of+Cas9+and+single+guide+RNA+genes+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">Successful transient expression of Cas9 and single guide RNA genes in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Eukaryotic Cell. 13 (11), 1465-1469 (2014).</li><li>Poe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+CRISPR/Cas9-Mediated+Tissue-Specific+mutagenesis+reveals+gene+redundancy+and+perdurance+in+Drosophila.">Robust CRISPR/Cas9-Mediated Tissue-Specific mutagenesis reveals gene redundancy and perdurance in Drosophila.</a> Genetics. 211 (2), 459-472 (2019).</li><li>Port, F., Chen, H., Lee, T., Bullock, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+CRISPR/Cas+tools+for+efficient+ger+mLine+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila.">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient ger mLine and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 2967-2976 (2014).</li><li>Yang, S., Li, S., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shortening+the+Half-Life+of+Cas9+maintains+its+gene+editing+ability+and+reduces+neuronal+toxicity.">Shortening the Half-Life of Cas9 maintains its gene editing ability and reduces neuronal toxicity.</a> Cell Reports. 25 (10), 2653-2659 (2018).</li><li>Port, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+resource+for+tissue-specific+CRISPR+mutagenesis+in+Drosophila.">A large-scale resource for tissue-specific CRISPR mutagenesis in Drosophila.</a> eLife. 9, 53865 (2020).</li><li>Zhang, X., Tee, L., Wang, X., Huang, Q., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+Effects+in+CRISPR/Cas9-mediated+Genome+Engineering.">Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 4 (17), 264 (2015).</li><li>Huynh, N., Depner, N., Larson, R., King-Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+toolkit+for+CRISPR-Cas13-based+RNA+manipulation+in+Drosophila.">A versatile toolkit for CRISPR-Cas13-based RNA manipulation in Drosophila.</a> Genome Biology. 21, 279 (2020).</li></ol>

O.S.A هي مؤسسة شركة Agragene، ولديها حصة في الأسهم، وتعمل في المجلس الاستشاري العلمي للشركة. وقد استعرضت جامعة كاليفورنيا في سان دييغو شروط هذا الترتيب ووافقت عليها وفقا لسياساتها المتعلقة بتضارب المصالح. جميع المؤلفين الآخرين لا يعلنون عن مصالح متنافسة.

مع ثلاثة تصاميم تطبيق مختلفة من نظام CasRx ، أظهر هذا العمل في استهداف الحمض النووي الريبي القابل للبرنامج في الذباب. تلبي الاستراتيجيات المختلفة احتياجات المشروع المختلفة ، مثل استهداف الجينات الذاتية مقابل الخارجية واستهداف الحمض النووي الريبي في كل مكان مقابل استهداف الحمض النووي الريبي الخاص بالأنسجة. وشملت آثار استهداف الحمض النووي الريبي التغيرات الجينية المستهدفة المحددة phenotypic، والحد من نص الحمض النووي الريبي المستهدف، والأنماط الظاهرية القاتلة في بعض الأحيان المرتبطة بالتعبير العالي عن بروتين CasRx والنشاط الجانبي. وعموما، أظهرت هذه النتائج أن نظام CasRx قادر على استهداف خفض نسخة الحمض النووي الريبي على مستوى الكائن الحي بطريقة قابلة للبرمجة والكفاءة.
أحد العوامل الرئيسية في تخصيص بنجاح نظام CasRx هو تصميم gRNAs. على وجه التحديد ، يجب أن يتم الاحتاء إلى النصيحة التالية: التسلسل المستهدف حوالي 30 نيوكليوتيدات في الطول ، وطول امتدادات poly-U في التسلسل المستهدف هو 4 أزواج أساسية أو أقل ، والتسلسل المستهدف محتوى GC في نطاق 30٪ - 70٪، ولا يتوقع أن يشكل التسلسل المستهدف هياكل دبوس شعر RNA قوية ، ويحتوي التسلسل المستهدف على الحد الأدنى من البنية الثانوية أو الثالثة المتوقعة للجيش الملكي النيبالي5.
بالإضافة إلى تصاميم الحمض النووي الريبي ، فإن خطوة علم الوراثة الذبابية في كل بروتوكول أمر بالغ الأهمية أيضا في التنفيذ الناجح. وجود أو عدم وجود الأنماط الظاهرية المحددة التي تنتقل من الآباء والأمهات في الذرى مهمة لتحديد وتحديد الأنماط الظاهرية الناجمة عن نظام CasRx في ذريات transheterozygous. أيضا، إعداد الصلبان التحكم باستخدام الذباب dCasRx بالتوازي هي أيضا مفيدة في استبعاد الأنماط الظاهرية غير محددة في ذريات transheterozygous.
تجدر الإشارة إلى أن هذه النتائج كشفت عن مشكلة سمية تم تقديمها من خلال التعبير عن بروتين CasRx و dCasRx في كل مكان في الذبابة ، وهو قيد على نظام CasRx. جاء التعبير في كل مكان من CasRx أو dCasRx تحت الترويجي Ubiq وحدها ، دون gRNAs ، مع تكاليف اللياقة البدنية غير تافهة ، كما لا يوبيك - CasRx ولا الذباب يوبيك - dCasRx يمكن أن تنشأ كخطوط homozygous. على العكس من ذلك ، يمكن تأسيس ذباب UASt-CasRx و UASt-dCasRx كمخزونات متجانسة صحية ، على الرغم من أنه بسبب تصميم مخطط الصليب تم الاحتفاظ بها كمخزونات متوازنة مزدوجة ، وهي حقيقة تدعم وجود السمية الناجمة عن التعبير البروتيني CasRx في كل مكان. قطعة أخرى من الأدلة الداعمة هي أنه في تجارب التحكم التي تنطوي على dCasRx ، وهو غير نشط بشكل تحفيزي ، كانت نسب الذباب التي تحمل كل من dCasRx و gRNA من إجمالي عدد الذباب في جيل F1 أقل باستمرار من 50 ٪ ، وكانت النسبة المتوقعة على أساس الوراثة المندلية إذا لم تكن هناك سمية مرتبطة ب dCasRx. وأشار هذا إلى أن التعبير عن dCasRx في كل مكان ، جنبا إلى جنب مع gRNAs ، يحفز السمية في الذبابة ، مما يؤدي إلى نسبة ميراث أقل من المتوقع. نسب الميراث من transheterozygous UASt-dCasRx، gRNA، الذباب GAL4 يتبع علم الوراثة المندلي، مما يشير مرة أخرى إلى السمية الناجمة على وجه التحديد عن طريق التعبير في كل مكان من البروتينات CasRx وdCasRx. السمية في نظام CRISPR / Cas ليست جديدة. وقد تبين أن كميات عالية من بروتين Cas9 سامة في العديد من الكائنات الحية، بما في ذلك الذباب29,30,31,32. وقد وضعت دراسة حديثة نظام GAL4/UAS مخصصة التي يمكن ضبط كمية البروتين Cas9 أعرب في الذباب عن طريق إضافة إطار القراءة المفتوحة من طول متفاوت بين تسلسل UAS وتسلسل Cas9 في بناء UAS-Cas933. لذلك ، يجدر استكشاف طرق للحد من السمية الناجمة عن CasRx عن طريق ضبط مستوى التعبير عن البروتين CasRx.
بخلاف السمية الناجمة عن التعبير في كل مكان من البروتينات CasRx و dCasRx ، أظهرت النتائج أيضا فتكا مرتبطا بالآثار الجانبية غير المحددة لنظام CasRx خارج الهدف ، وهي سمة للعديد من أنظمة CRISPR1،2،7،34. في بعض الذباب CasRx والجينات غير الأساسية التي تعبر عن الحمض النووي الريبي المزدوج أو الثلاثي transheterozygous ، على سبيل المثال عند استهداف Notch ، يكون لدى ذباب Transheterozygous CasRx مستويات أقل بكثير من معدل البقاء على قيد الحياة مقارنة بالذباب dCasRx transheterozgyous. في تحليل الحمض النووي الريبي-seq لهذه الذباب CasRx وgRNA التعبير transheterozygous، لوحظ كل من انخفاض مستويات النص الجيني المستهدف والحد من النصوص الجينية غير المستهدفة. وكانت هذه الآثار الجانبية تعتمد على CasRx وتعتمد على الهدف، كما لوحظت فقط في الذباب transheterozygous التعبير عن كل من البروتين CasRx وgRNA. تجدر الإشارة إلى أن واحدة من الجينات المستهدفة ، البيضاء ، أظهرت انخفاضا محدودا وغير ذي دلالة إحصائية في النصوص عندما تم استهداف الجين الأبيض من قبل CasRx ، والذي كان على النقيض من النمط الظاهري الواضح للحد من الصباغ. ومن المفترض أن هذا قد يكون راجعا إلى حقيقة أن 1) توقيت جمع عينة الحمض النووي الريبي-seq لم يكن متوافقا بشكل جيد مع التوقيت عندما يصل الجين الأبيض إلى ذروة التعبير خلال التطور المبكر، و 2) التعبير المترجم للجين الأبيض في العينين يجعل من الصعب جمع الأنسجة ذات الصلة خلال مرحلة التطوير المبكر عندما يكون جمع عينات الجسم كله فقط ممكنا. وللحد من النشاط الجانبي في نظام CasRx، تدعو الحاجة إلى إجراء دراسات في المستقبل لفهم الآليات الكامنة وراء نظام الظاهرة خارج الهدف فهما كاملا على مستوى الكائنات الحية.
ومن المثير للاهتمام، دراسة حديثة35 تصف أدوات Cas13 استهداف الحمض النووي الريبي في الذباب ويبدو أن تحسين السمية العامة المرتبطة التعبير CasRx، لعدة أسباب محتملة. أولا ، أعاد المؤلفون ترميز المتحولين Cas13 لتحسين التعبير في Drosophila واستخدموا مروجا أكثر ضعفا (actin 5C) مقارنة بمروج كل مكان المستخدم في هذه الدراسة ، مما يؤدي على الأرجح إلى مستويات أقل من تعبير Cas13 وبالتالي سمية أقل. في الواقع ، يدعم هذا الملاحظات التي لم يكن تعبير CasRx و dCasRx مدفوعا ب UASt ، في حد ذاته ، ساما ، لأن هذه الدراسة (والمؤلفين في 35) لم يلاحظوا أي فتك واضح في ذباب UASt-CasRx. وعلاوة على ذلك، قام هؤلاء المؤلفون بترميز الحمض النووي الريبي بشكل مختلف مقارنة بهذه الدراسة، والتي ربما أثرت على تعبيرهم وخفضت سمية النظام في ذباب ترانسهيتروزيغوس Cas13/gRNA. على سبيل المثال، في دراستهم تم التعبير عن اثنين من gRNAs باستخدام المروج U6:3 ويحيط بها tRNAs لتمكين تجهيز الحمض النووي الريبي عند نضوج الحمض النووي الريبي دون الحاجة CasRx35. وعلى العكس من ذلك، في هذه الدراسة، تم ترميز الحمض النووي الريبي كصفائف تستهدف ما يصل إلى 4 مواقع لكل جين وتقليد بنية صفيف Cas13 الذاتية الموجودة في البكتيريا، والتي تتطلب أنزيم Cas13 لمعالجة كل gRNA. وربما أدت هذه النهج المختلفة إلى اختلافات في مستويات التعبير عن الحمض النووي الريبي وعوامل أخرى قد تكون لها آثار متأصلة على سمية النظام بأكمله. وأخيرا، استهدف هوينه وآخرون جينات مختلفة عن تلك المستهدفة في هذه الدراسة، مما يؤدي إلى اختلافات في التفاعل بين الهدف وكاس/الجيش الملكي النيبالي والنشاط الجانبي وقد تكون له آثار على المستويات الملاحظة من الفتك. وهذه الاختلافات في السمية الملاحظة تبرر إجراء مزيد من التحقيقات لتحديد السبل التي يمكن بها تحسين النظم العامة.
وعموما، فإن هذه الدراسة هي أول عرض لنظام كاس ترميز الحمض النووي الريبي الوظيفي المشفر وراثيا في D. melanogaster، وإن كان من الضروري زيادة تحسين نظام CasRx (بما يتماشى مع ما تم الإبلاغ عنه35) لزيادة الحد من الفتك خارج الهدف وزيادة فعالية شق CasRx على الهدف. استهداف الحمض النووي الريبي مع إنزيمات Cas هو مجال يتطور بسرعة مع العديد من التطبيقات المحتملة التي تتراوح بين مكافحة ناقلات الحشرات إلى الاستخدامات العلاجية1،2،3،4،5،6،7 ، وهذا البروتوكول يقدم حزمة بداية لأي شخص مهتم بتصميم نظام CasRx الأول في الذباب ، مع التوافق مع التخصيص وزيادة تحسين النظام. وتبين الأمثلة المعروضة هنا مجموعة من النتائج التي قد يواجهها المرء أثناء تنفيذ هذا النظام في الجسم الحي، وقد تكون بمثابة معايير للمستخدمين الآخرين في تقييم أداء نظام CasRx في تطبيقاتهم.

منذ ظهور تقنيات تكرارات باليندروميك القصيرة المتشابكة بانتظام (CRISPR) ، كان الكثير من التركيز في هذا المجال على تحرير الحمض النووي ، والذي يقدم تطبيقات تحويلية في الطب والتكنولوجيا الحيوية1. ومع ذلك، فإن التغيير الدائم لتسلسل الحمض النووي ليس مرغوبا دائما بسبب الاعتبارات الأخلاقية. وفي ضوء ذلك، بدأت الدراسات الحديثة في تطوير أدوات قائمة على كريسبر لاستهداف الحمض النووي الريبي وأظهرت أن تكنولوجيات CRISPR يمكن استخدامها بالفعل لاستهداف الحمض النووي الريبي في مجموعة متنوعة من النظم البيولوجية2,3,4,5,6,7. في العديد من هذه الأنظمة التي تم اختبارها ، فإن النهج الحالي المستخدم على نطاق واسع لاستهداف الحمض النووي الريبي والحد من النسخ هو تداخل الحمض النووي الريبي (RNAAi) ، وهو أبعد ما يكون عن الكمال ، وغالبا ما يظهر فعالية متنوعة ونشاطا مرتفعا خارج الهدف عند استخدامه في vivo8 و 9 و 10 و 11 و 12 و 13 و 14 و 15 و 16 و 17 . ولذلك، وبالنظر إلى حالة هذه التكنولوجيات، يجدر مواصلة استكشاف إمكانات الأدوات القائمة على كريسبر لاستهداف الحمض النووي الريبي.
وذكرت إحدى الدراسات الحديثة البارزة أن ريبونوكليز كاسرإكس، وهو عضو في فئة Cas13d، يمكن أن يقلل بكفاءة من مستويات النسخ الجينية في ثقافة الخلايا البشرية ويمتلك ملفا شخصيا جذابا خارج الهدف4. أدت هذه النتيجة إلى مسألة ما إذا كان هذا الريبونوكليا الجديد يمكن الحفاظ على فعاليته وانخفاض معدل خارج الهدف لاستهداف الحمض النووي الريبي على مستوى الكائن الحي. تناولت دراسة حديثة هذه المسألة من خلال إظهار أنه يمكن استخدام نظام CasRx لتحقيق تخفيض في كل مكان والنص الجيني الخاص بالأنسجة في Drosophila melanogaster5.
لتبسيط قابلية استخدام هذا النهج المنشور مؤخرا، يفصل هذا البروتوكول الأساليب من هذا العمل الأخير، الذي يتكون من ثلاثة أجزاء رئيسية: 1) في كل مكان في استهداف الحمض النووي الريبي الحي باستخدام نظام CasRx مكون من مكونين؛ 1) في كل مكان في الجسم الحي RNA استهداف باستخدام نظام CasRx مكونين؛ (2) في كل مكان في نظام CasRx مكونين؛ (2) في كل مكان في نظام CasRx مكون من مكونين؛ (2) في كل مكان في نظام CasRx المكون من مكونين؛ (2) في كل مكان في نظام CasRx المكون من مكونين؛ (2) في كل مكان في نظام CasRx المكون من مكونين؛ (2) في كل مكان في نظام 2) في كل مكان في الجسم الحي الخارجي الجيش الملكي النيبالي استهداف باستخدام نظام CasRx ثلاثة مكونات؛ و 3) الأنسجة specificin في الجسم الحي الجيش الملكي النيبالي استهداف باستخدام نظام CasRx ثلاثة مكونات.
تم تصميم دليل الحمض النووي الريبي (gRNA) الذي يستهدف الجينات المستهدفة المختلفة تحت سيطرة مروج في كل مكان وتم إنشاء خطوط طيران تعبر عن هذه البنى المحتوية على الحمض النووي الريبي. تم تصميم بنيات CasRx تحت سيطرة إما مروج في كل مكان ، أو مروج تسلسل تنشيط المنبع المشروط (UASt) القابل للتفعيل بواسطة عامل النسخ GAL4 ، وخطوط الطيران التي تؤوي هذه البنى المحتوية على CasRx التي تم إنشاؤها. تم تصميم وبناء CasRx غير نشطة بشكل حفاز، dCasRx، واستخدامها كعناصر تحكم سالبة. يتم تحقيق استهداف الحمض النووي الريبي في كل مكان في الذباب من خلال عبور خطوط الطيران المعبرة عن الحمض النووي الريبي مع خطوط الطيران المعبرة عن CasRx في كل مكان. ذرية التعبير عن كل من بناء الحمض النووي الريبي التي تستهدف نسخة جينية محددة وبروتين CasRx لديه انخفاض في كل مكان من النصوص الجينية المستهدفة. يتم تحقيق استهداف الحمض النووي الريبي الخاص بالأنسجة في الذباب من خلال عبور الذباب المعبر عن الحمض النووي الريبي لأول مرة مع UASt-CasRx الذي يعبر عن الذباب ، والحصول على ذباب transheterozygous يحمل كلا من GRNA و UASt-CasRx. يتم عبور مثل هذه الذباب بدوره مع الذباب المعبر عن GAL4 الخاص بالأنسجة ، مما يؤدي إلى توليد تعبير CasRx الخاص بالأنسجة واستهداف الحمض النووي الريبي في الذباب.
توفر الطبيعة القابلة للبرمجة لنظام CasRx إمكانية التخصيص والتحسين للمساعدة في تحقيق فعالية عالية ونشاط منخفض خارج الهدف لاستهداف الحمض النووي الريبي الحي. التطبيقات المحتملة لاستهداف الحمض النووي الريبي القائم على CRISPR عديدة ، بما في ذلك استبدال الحمض النووي الريبي في المختبر والمساهمة في مكافحة ناقلات الحشرات في البرية. ومن بين هذه الاحتياجات الأخيرة، هناك حاجة عالمية لم تلب بعد، وهي استحداث أدوات فعالة لمكافحة عدوى فيروسات الحمض النووي الريبي التي تنتقل عن طريق البعوض. وينتقل العديد من فيروسات الحمض النووي الريبي، مثل حمى الضنك وزيكا وشيكونغونيا، عن طريق البعوض، مما يؤثر على صحة الإنسان، ويساهم في الوفيات. وقد قدمت مقترحات عديدة لهندسة أعداد البعوض التي لديها مقاومة للفيروسات للوقاية من الأمراض؛ ومع ذلك ، لا توجد تكنولوجيا حالية قادرة على جعل البعوض مقاوما في وقت واحد لجميع فيروسات الحمض النووي الريبي الهامة18،19،20،21،22،23. وقد توفر أنظمة Cas التي تستهدف الحمض النووي الريبي نقطة انطلاق لمثل هذه التكنولوجيا من خلال تمكين منصة قابلة للبرمجة لاستهداف جميع فيروسات الحمض النووي الريبي التي يحملها البعوض.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% Grape Juice</td>
			<td>Welch Foods Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Active Dry Yeast (908g)</td>
			<td>Red Star Yeast Company, LLC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMC4500 color camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMC4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAL4-GMR flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>29967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAL4-y flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>44373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glomax 20/20 Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq2500 Sequencer</td>
			<td>Illumina, Inc.</td>
			<td>HiSeq2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M165FC fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop OneC UV-vis spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>NDONEC-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit</td>
			<td>New England Biolabs, Inc.</td>
			<td>E7770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 112686</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 112688</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132416</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132417</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132419</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132420</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132421</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132422</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132425</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132426</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 133304</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>133304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 164586</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>164586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid #132418</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pJFRC81</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>36432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases AscI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0558L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases NotI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases PacI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0547L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases PstI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0140L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases SwaI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0604L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases XbaI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0145L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico Kit for Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbo DNase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6-3:4-gRNA-Fluc flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6-3:4-gRNA-GFP; OpIE2-GFP flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6-3:4-gRNA-N flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6-3:4-gRNA-w flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6-3:4-gRNA-y flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UASt-CasRx flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UASt-dCasRx flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiq-CasRx flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiq-dCasRx flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiq-Firefly-T2A-eGFP-Ubiq-Renilla flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymoclean Gel DNA Recovery Kits</td>
			<td>Zymo Research Corporation</td>
			<td>D4007</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ubiquitous and tissue-specific rna targeting in drosophila melanogaster using crispr/casrx

CasRx ، وهو عضو في عائلة Cas13 التي تستهدف الحمض النووي الريبي ، هو إضافة جديدة واعدة لتقنيات CRISPR / Cas في تقليل نسخة الجينات الفعالة مع ملف تعريف جذاب خارج الهدف على المستويين الخلوي والكائن الحي. وتفيد التقارير مؤخرا أن نظام CRISPR / CasRx يمكن استخدامها لتحقيق خفض النص الجيني في كل مكان والأنسجة محددة في Melanogaster Drosophila. هذه الورقة تفاصيل أساليب العمل الأخير، وتتألف من ثلاثة أجزاء: 1) في كل مكان في الجسم الحي RNA الذاتية استهداف باستخدام نظام CasRx مكونين؛ 2) في كل مكان في الجسم الحي الداخلي RNA استهداف باستخدام نظام CasRx مكونين؛ 2) في كل مكان في الجسم الحي. 2) في كل مكان في الجسم الحي الخارجي الجيش الملكي النيبالي استهداف باستخدام نظام CasRx ثلاثة مكونات؛ و 3) الأنسجة محددة في الجسم الحي الجيش الملكي النيبالي استهداف باستخدام نظام CasRx ثلاثة مكونات. وتشمل آثار استهداف الحمض النووي الريبي الملاحظ التغيرات الجينية المحددة المستهدفة، والحد من نسخة الحمض النووي الريبي المستهدف، والأنماط الظاهرية المميتة في بعض الأحيان المرتبطة بالتعبير العالي عن بروتين CasRx والنشاط الجانبي. بشكل عام ، أظهرت هذه النتائج أن نظام CasRx قادر على استهداف تقليل نسخة الحمض النووي الريبي على مستوى الكائن الحي بطريقة قابلة للبرمجة والكفاءة ، مما يدل على أنه في استهداف النسخ الحية ، والهندسة ممكنة وتضع الأساس للمستقبل في تقنيات استهداف الحمض النووي الريبي المستندة إلى vivo CRISPR.

Watch this Scientific Journal Video about Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx at JoVE.com

Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx

توضح هذه المقالة بروتوكول مفصل لاستخدام إنزيم Cas13D (RfxCas13D) الذي يستهدف الحمض النووي الريبي في الذباب.

استهداف الحمض النووي الريبي في كل مكان والأنسجة محددة في Drosophila Melanogaster باستخدام CRISPR / CasRx

CasRx, a member of the RNA-targeting Cas13 family, is a promising new addition of the CRISPR/Cas technologies in efficient gene transcript reduction with ...

كما يظهر بروتوكولنا ، يمكن استخدام تقنيات CRISPR CasRx لتحقيق تخفيضات في كل مكان وأنسجة محددة في نص الجينات في ذباب الفاكهة. تقدم تقنيتنا حزمة بداية لأي شخص مهتم باستخدام تخفيض نسخة الجينات المستندة إلى CRISPR في ذباب الفاكهة مع التوافق مع المزيد من التخصيص والتحسين. لإعداد في كل مكان في الجسم الحي الجيش الملكي النيبالي استهداف باستخدام نظام CasRx مكون اثنين، وجمع 10 الذباب الإناث البالغة العذراء من خط gRNA homozygous من الفائدة وخمسة الذباب الذكور البالغين من متوازن heterozygous يوبيك CasRx CurlyO.ضع الذباب الأبوي في قارورة مكملة ب 100 ميكروغرام من مسحوق الخميرة الجافة وخلفية القنينات لمدة 48 ساعة عند 26 درجة مئوية. مراقبة قنينات كل يوم لمعرفة ما إذا كان أي ذرية الكبار جديدة قد ظهرت من العانة من جيل F1 وتخدير أي من البالغين مع ثاني أكسيد الكربون لمدة 10 ثانية. بمجرد أن يصبح الذباب غير متحرك فارغة القارورة على لوحة ذبابة متصلة بخزان ثاني أكسيد الكربون مع ثاني أكسيد الكربون المستمر واستخدام كاميرا ملونة متصلة مجهر ستيريو الفلورسنت لتسجيل وصورة الأنماط الظاهرية للذباب.ثم عد أعداد ذرية مع الأنماط الظاهرية المختلفة، وفقا للتعبير إشارة الفلورسنت. استنادا إلى علم الوراثة المندلي، من المتوقع أن يعبر 50٪ من السلف عن الحمض النووي الريبي المستهدف. لاحظ أن سمية نظام Ubiq CasRx قد تقلل من نسبة الحمض النووي الريبي المستهدف الذي يعبر عن ذرية إلى أقل من 50٪ لإعداد في كل مكان في استهداف الحمض النووي الريبي الخارجي في الجسم الحي باستخدام نظام CasRx مكون من ثلاثة مكونات ، وجمع ثمانية إلى 10 ذباب أنثى بالغة عذراء من خط تعبير مزدوج من لوسيفراز وأربعة إلى خمسة ذباب ذكور بالغين من heterozygous Ubiq CasRx Curly بالإضافة إلى TM6 ، STB الخط الذي يعرض عيون بيضاء، أجنحة مجعد، وDS مضان أحمر في وقت واحد.وضع الخطوة الأبوية واحدة عبر من قبل في قارورة تكملها 100 ميكروغرام من مسحوق الخميرة الجافة والخلفية هذا الصليب لمدة 48 ساعة في 26 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، قم بإزالة جميع الذباب الأبوي من كل قارورة وأعيد القنينات إلى حاضنة 26 درجة مئوية لمدة 14 يوما على الأقل. على مدى 14 يوما، كما ذكر سابقا جمع ثماني إلى 10 العذارى الإناث من اليراع اليراعات المثلية لوسيفيراز التي تستهدف خط الجيش الملكي النيبالي ثلاث مرات.مراقبة خطوة واحدة عبر قوارير كل يوم لمعرفة ما إذا كان أي ذريات الكبار جديدة قد ظهرت من الخوخ، تخدير مع ثاني أكسيد الكربون للسماح لجمع من أربعة إلى خمسة الذباب الذكور التعبير عن كل من يوبيك CasRx ومراسل لوسيفراز المزدوج كما هو متاح. وضع الذباب في قارورة جديدة مع 10 الإناث العذراء من ذبابة الفاكهة luciferase استهداف خط gRNA، ووضع هذه الخطوة اثنين الصلبان في 26 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. جمع آخر خمسة يوم واحد من الذكور الذين يعبرون عن كل من Ubiq CasRx ومراسل لوسيفراز مزدوجة من قنينات الصليب خطوة واحدة واحتضان الذباب لمدة يومين إلى أربعة أيام وحدها في 26 درجة مئوية قبل نقلها إلى جهاز طرد مركزي 1.5 ملليلتر لتخزين ناقص 80 درجة مئوية.في نهاية الحضانة، قم بإزالة جميع قوارير الوالدين من كل قنينة من قنينات الصليب الخطوة الثانية. وإرجاع القنينات إلى حاضنة 26 درجة مئوية لمدة 20 يوما على الأقل. مراقبة الخطوة اثنين من قوارير الصليب كل يوم لمعرفة ما إذا كان أي ذرية الكبار جديدة قد ظهرت من العانة، تخدير الذباب مع ثاني أكسيد الكربون لأنها تصبح متاحة، وتسجيل وتصوير الأنماط الظاهرية الخاصة بهم كما هو موضح.تشير الوراثة المندلية إلى أنه إذا كانت جميع الذباب قابلة للحياة ، فيجب على 25٪ من السلف التعبير عن الحمض النووي الريبي المستهدف. لإجراء فحص لوسيفيراز، قم بتوليد ذباب الهتروزيغوس الثلاثي وكذلك ذباب التحكم كما هو موضح. جمع الذباب الذكور عند الولادة، والشيخوخة لهم حتى ثلاثة أيام من العمر.نقل الذباب البالغ من العمر ثلاثة أيام إلى أنابيب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر، وتحلل لهم باستخدام عازلة في العازلة تحلل لوسيفيراز من عدة المقايسة لوسيفيراز المتاحة تجاريا. ثم استخدم خمسة ميكرولترات من الأنسجة المفروصة من كل عينة ومقياس الإنارة لقياس كل من ذباب الفاكهة وركض نشاط لوسيفيراز ، وفقا لبروتوكولات فحص لوسيفراز القياسية. F1، عبر heterozygous CasRx، لديها معدلات بقاء أقل بكثير بالمقارنة مع الذباب عبر heterozygous dCasRx.وتأكيدا لسمية نظام يوبيك كاسرإكس للجينات الثلاث المستهدفة، فإن ذباب U6 gRNA Y heterozygous غير قابل للحياة ولا ينمو إلى ما بعد المرحلة الثانية من يرقات النجوم. على قيد الحياة Ubq CasRx وU6 gRNA W heterozygous الذباب، وإظهار متميزة البنتانت تماما نمط الظاهري واسعة العينين. وبالإضافة إلى ذلك، لوحظ أيضا انخفاض كبير في النصوص الجينية المستهدفة لثلاث جينات مستهدفة.ويلاحظ أيضا دليل على النشاط خارج الهدف الناجم عن CasRx عند مقارنة النصوص التفاضلية المعبر عنها بين عينات من CasRx تعبر عن الذباب وعينات من dCasRx تعبر عن الذباب. في تقاطع الخطوتين ، يؤدي فقط الجمع بين جميع الجينات الثلاثة العابرة إلى فتك بنسبة 100٪. عندما يتم استخدام الأنسجة محددة RNA استهداف باستخدام ثلاثة مكونات تصميم نظام CasRx، يتم تقليل مستوى السمية عندما يتم خفض التعبير CasRx الشاملة باستخدام المروج UAST بالمقارنة مع أن من المروج يوبيك.من المهم إعداد العملية الوراثية بشكل صحيح باستخدام الذباب من النوع الصحيح والأنماط الظاهرية الصحيحة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

فحوص للكشف عن العوامل رني المضيفة المعنية في الوقس عدوى فيروس باستخدام ذبابة الفاكهة خلايا

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

RNA Interference in Ticks

التدخل في الحمض النووي الريبي القراد

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

باستخدام الحمض النووي الريبي التدخل للتحقيق في الاستجابة المناعية الفطرية في الفأر الضامة

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

قفيصة منواة التليين بوساطة الكهربائي (NAME) الفحص يسمح للتحديد السريع لHIV-1 قفيصة منواة مثبطات

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

العدوى البكتيرية النظامية والمناعة الظواهر الدفاع في<em&gt; الدروسوفيلاميلانوجاستر</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

الكشف الموضعي من البكتيريا داخل أنسجة البارافين جزءا لا يتجزأ من استخدام المسمى الديجوكسين DNA التحقيق استهداف 16S الريباسي

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

استهداف بيوفيلم أسوشيتد<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em&gt; استخدام ريسازورين استنادا الفحص المخدرات-القابلية

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

استهداف ثيولس سيستين في المختبر جليكوسيليشن الخاصة بالموقع من البروتينات المؤتلف

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

استخراج هيموسيتيس من اليرقات melanogaster المورفولوجية للعدوى الميكروبية والتحليل

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

إنشاء العدوى الفيروسية، وتحليل التفاعل المضيف للفيروسات في Melanogaster المورفولوجية

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...