مقايسة لتحريض العصبية في الأجنة الفرخ

Summary

الحث العصبي هو الخطوة الأولى في تكوين الدماغ. وهو الآلية التي عقدة هنسن (المنظم) ، يرشد النسيج المجاور لاعتماد مصير العصبية ، أي أن تثير الجهاز العصبي. هذا الفيديو يوضح مقايسة لتحريض العصبي في الأجنة الفرخ.

Abstract

الجنين الفرخ هو أداة قيمة في دراسة التطور الجنيني المبكر. شفافيته ، وسهولة الوصول وسهولة التلاعب ، وجعلها أداة مثالية لدراسة تشكيل والزخرفة الأولية للنظام العصبي. هذا الفيديو يوضح كيفية نسيج منظم الكسب غير المشروع إلى المضيف ، والطريقة التي يتم المطعمة عقدة هنسن ق (المنظم في جنين الفرخ) إلى الأديم الظاهر المضيف المختصة. الكسب غير المشروع منظم يرشد المغطي غ لقد الأنسجة لاعتماد مصير العصبية عبر إشارات العصبية المحفزة. ويشار إلى هذه الآلية والحث العصبي ، ويشكل الخطوة الأولى في تكوين الدماغ والحبل الشوكي في amniotes. ويستخدم هذا الأسلوب أساسا لتوصيف جزيئات المفترضة تحريض العصبي في الفرخ. هذا الفيديو يوضح الخطوات المختلفة في مقايسة لتحريض العصبي ؛ أولا ، explanted الجنين donnor ويعلق على طبق. ثم ، على استعداد الجنين المضيف للثقافة الجديدة. والكسب غير المشروع ورفعه إلى الهامش زرع المنطقة الشفافة المضيف. هو مثقف المضيف 18-22 ساعة. تم إصلاح التجمع وتجهيزها لتطبيقات أخرى (مثل التهجين في الموقع). ولقد ابتكر هذا الأسلوب أصلا بواسطة ادينغتون

Protocol

أولا تخطيطي لمحة عامة :

هذا الفيديو يوضح الخطوات المختلفة في مقايسة لتحريض العصبي في الأجنة الفرخ. الأول ، هو explanted الجنين المضيف في ثقافة جديدة [NI1]. إذن ، هو explanted الجنين donnor في المياه المالحة وعقدة هنسن (في "منظم" في الفرخ) هو المسمى مع صبغة الفلورسنت الجاذبة [NI2]. ويستأصل عقدة هنسن من جنين donnor [NI3] وزرع الجنين إلى المضيف [NI4 ، NI5]. هو مثقف ثم الجنين المضيف لتصل إلى 22 ساعة ، وبعد هذه الفترة النسيج donnor قد يسببها محور خارج الرحم في منطقة المضيف المعتمة [NI6]. التالية والثقافة ، ويتم إصلاح الجنين المضيف والمجهزة للphotooxidation في حضور DAB : بواسطة هذا التفاعل الكيميائي ، والخلايا المشتقة donnor ، والتي تظهر تحت الحمراء مضان FITC قبل photooxidation [NI7] ، وتصبح ردود الفعل التالية البني مع DAB [NI8]. ثم تتم معالجة الجنين للتهجين في الموضع مع علامة العصبية [NI8] ؛ الأنسجة المشتقة المضيف شكلت الأنسجة العصبية في وجود الفساد donnor. هذا النسيج يظهر اللون الأزرق.

1 : تحضير الجنين المضيف لثقافة جديدة

1. هذا الاختبار الحث العصبي بروتوكول يبدأ مع البيض التي تم المحتضنة للهمبرغر وهاميلتون المرحلة 3 ⁺ (أو HH3 ^+). وقد حضنت هذه البويضات وضعت على جانبهم في حاضنة الرطبة لمدة 13 ساعة.
2. تحضير الجنين المضيف لثقافة جديدة (الخطوات 3.1. إلى 5.5 ^9).
3. تغطية سطح الجنين المضيف مع 200 ميكرولتر المالحة. وهذا تسهيل نقل في وقت لاحق وتحديد المواقع من الكسب غير المشروع donnor.
4. أخيرا ، تغطية التجمع مع مقلوب فالكون 35 مم طبق الثقافة.

2 : Explanting الجنين donnor في المياه المالحة

1. فتح البويضة بواسطة التنصت على قذيفة بالملقط وإزالة قطعة من قذيفة ، في جميع أنحاء قذيفة. إزالة رأس قذيفة وتجاهل.
2. إزالة ألبومين سميك بالملقط ، والميل كيس المح مع ملقط الخشنة بحيث الجنين يواجه صعودا.
3. باستخدام مقص غرامة ، وقطع مربعة من الكيس المحي حول الجنين. إزالة الجنين من صفار البيض مع ملعقة ، والمكان في صحن يحتوي على برنامج تلفزيوني.
4. باستخدام الملقط ، فصل الجنين donnor الشفافة من المنطقة.
5. donnor نقل الجنين الى صحن Sylgard مغطاة تحتوي على برنامج تلفزيوني.

3 : وضع العلامات ، واستئصال وزرع donnor الكسب غير المشروع

1. باستخدام مجتذب microelectrode ، وسحب 50 ميكرولتر microcapillary ماصات زجاجية. تحت المجهر ، وقطع غيض من micropipette باستخدام الملقط الغرامة. واصطف micropipette مكان في طبق بتري بشريط من plasteline.
2. تحضير محلول الصبغة التي سيتم استخدامها لتسمية طعم قبل الزرع : carbocyanine الصبغة الجاذبة (1،1 '- dioctadecyl - 3 ، 3،3' ، 3' - tetramethylindocarbocyanine البركلورات) : أولا ، إعداد وتقييم الجاذبة في 1ml المطلقة الإيثانول بنسبة 0.5 ٪. ويمكن تخزين هذا المخزون في دورتها الحادية و20C في الظلام. في حمام مائي وضعت في درجة حرارة 42 درجة مئوية ، 40 prewarmed مزيج الأسهم الجاذبة ميكرولتر إلى سكروز 0.3M 360μl. درجة حرارة مياه الاستحمام أمر ضروري من أجل منع ترسب الجاذبة وتشكيل بلورات غير قابلة للذوبان. تدور لفترة وجيزة على حل spectrafuge مصغرة (لثانية 5-10). الحل الجاذبة الآن جاهزة للاستخدام.
3. باستخدام دبابيس الحشرات ، وتأمين donnor الجنين في أسفل الطبق Sylgard تغطيتها.
4. العودة ملء micropipette مع الجاذبة. من خلال تطبيق ضغط لطيف باستخدام أنبوب التجميع الشافطة ، وتطبيق بلعة صغيرة من الجاذبة إلى عقدة هنسن. تأكد من تسمية كامل عقدة هنسن.
5. باستخدام ماصة microcapillary أو سكين microdissecting ، وقطع عقدة هنسن ("المنظم" ، donnor الكسب غير المشروع).
6. علامة الجانب البطني ونهاية الخلفي من الكسب غير المشروع مع القرمز. وهذا ضمان أن يتم وضع الطعم مع التوجه السليم بطني ظهراني في الخطوة 4.3.
7. باستخدام ماصة 200μl جيلسون ، ونقل والكسب غير المشروع إلى الجنين المضيف.

4 : تأمين الكسب غير المشروع وزرع الجنين المضيف

1. إزالة الملوحة من الجنين المضيف ، والتأكد من الكسب غير المشروع لا يزال وضعه على مقربة من موقع المضيف.
2. باستخدام ماصة microcapillary أو سكين microdissecting ، إجراء شق صغير (80 100μm) في منطقة الشفافة / منطقة الحدود المنطقة المعتمة ، على مستوى عقدة هنسن من جنين المضيف.
3. باستخدام ماصة microcapillary أو سكين microdissecting الموقف ، والكسب غير المشروع بحيث يواجه الجانب البطني نحو لكم ونهاية الخلفي موازية لمنطقة ما يعادلها في الجنين المضيف.
4. إزالة الملوحة المتبقية ، وعملية الجنين المضيف للثقافة الجديدة من أجل 81-22 ساعة (الخطوات 6،1-6،6 ^9).
5. ثم يتم إصلاح الجنين المضيف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (الخطوات 7،1-7،7 ^9).

ه "> 5 : Photooxidise الكسب غير المشروع في إطار مضان

1. تحت غطاء الدخان ، يعد حل DAB العاملة في تريس العازلة : ذوب الركيزة DAB (3،3 '- diaminobenzidine tetrahydrochloride) في تريس العازلة (100mM تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.4) في 500μg/ml ؛ ابقاء الحل في الظلام ، وعلى الثلج.
2. غسل الجنين مرتين في برنامج تلفزيوني لمدة 5 مليون مرة واحدة في كل وتريس العازلة لمدة 5 مليون سهم.
3. نقل الجنين الى تجويف كوب الشريحة تحتوي على 1 مل تريس العازلة.
4. استبدال الحل تريس العازلة مع 1.5 مل من محلول DAB. التخلص من غيض إيبندورف في دلو يحتوي على محلول التبييض 10 ٪ من أجل تطهير DAB. ساترة وضع على رأس الشريحة تجويف.
5. تحت مضان (فلوريسئين ثيوسيانات) FITC ، والتركيز على الهدف من هذا المجهر على الكسب غير المشروع (الخلايا الحمراء سوف تظهر donnor الفلورسنت) وفضح لمضان FITC حتى جميع الخلايا الحمراء الفلورسنت أصبحت البني (وهذا يحدث نتيجة لالجاذبة ملون تألقي يجري photoconverted لبلورات البني غير قابلة للذوبان ، من خلال التعرض لموجة الإثارة FITC (488nm) في حضور DAB. تستغرق هذه العملية ما بين 20 مليون و 2 ساعة.
6. بعد الانتهاء من رد الفعل photooxidation ، إزالة ساترة باستخدام الملقط الغرامة. نقل الجنين الى قارورة من الزجاج التلألؤ 20 مل تحتوي على PBTw (أو برنامج تلفزيوني مع 0.1 ٪ توين - 20).
7. تنشيط DAB ساترة من تجويف والزجاج الشريحة التي تفرخ في محلول التبييض 10 ٪.

6 : عملية الجنين في الموقع عن التصوير الفوتوغرافي ، والتهجين وsectioning

1. المضي قدما في الموقع التهجين (الخطوات 3،7-6،5 ⁹⁾ ، لاحتضان الجنين DIG المسبار المسمى فقط.
2. المضي قدما في تصوير (8.2 الخطوة ⁹⁾ وsectioning (الخطوات 8،3 8،4 و ^9).

ممثل النتائج

في المثال التالي من مقايسة الحث العصبي ، يظهر طعم donnor لحث على التعبير عن أبتر من الأنسجة العصبية علامة المضيف مشتقة. في هذا المثال معينة ، قمنا بتقييم اكتساب القدرة على إحداث العصبية الجنينية في المناطق التي عادة لا يكون "منظم" قدرات : الكسب غير المشروع donnor تنبع من جنين التي كانت "منظم" منطقة ازالتها جراحيا من الجنين في مرحلة donnor 3 ^+. بعد التذرية ، لا يسمح للجنين لتطوير donnor في الثقافة الجديدة ، حتى ثقب تعافى وبنية تشبه عقدة هنسن وقد تشكلت. يسمى هذا الهيكل ثم مع صلاح الغيدان ، يستأصل من الجنين donnor والمطعمة على حدود المنطقة المعتمة الشفافة / منطقة جنين المضيف. التالية الثقافة الجديدة ، وتشكيل محور مصغرة المتاخمة لجنين المضيف : هذا المحور مصغرة تتكون من قضيب من خلايا الدم الحمراء (donnor المشتقة) وهيكل رأس مثل (المضيف المشتقة) : في الفقرة (أ) ، المشتقة من donnor الجاذبة المسمى وتظهر الخلايا قبل تثبيت تحت المجهر مضان FITC. وقد تكاثرت هذه الخلايا المشتقة من donnor لتشكيل notochord مصغرة ، والتي كما يبدو قضيب من خلايا الدم الحمراء. (ب) photoconversion عقب الجاذبة ، وهذه الخلايا المشتقة من donnor تظهر البني. والكسب غير المشروع الناجم donnor تشكيل الأنسجة العصبية من المضيف : هذا النسيج يتكون من السلائف للمخ ، كما يتضح من التعبير عنها ما يلي علامة أبتر التهجين في الموضع [طبع في الفترة من 6].

ملاحظة : في هذا الإجراء ، ونحن قد استخدمت خلايا الجاذبة المسمى من أجل التفريق الأنسجة العصبية donnor حمل (الأحمر / البني) مشتقة من المضيف "العصبية" الأنسجة (الأزرق). بدلا من استخدام كتكوت المشتقة ، صلاح الغيدان donnor الكسب غير المشروع المسمى ، وبعض الكتاب أيضا استخدام donnor الأنسجة المشتقة من الأجنة السمان بدلا من الفرخ [على سبيل المثال 6]. هذا أسلوب بديل يسمح أيضا للتمييز donnor من الأنسجة المضيف. في هذه الحالة ، والكسب غير المشروع (donnor الأنسجة) تنبع من بيض السمان بدلا من بيض الدجاج. الخطوة التالية هي حذف 4.5 ، يتم معالجة المضيف المناعية لتحميل كامل مع جسم معين إلى الأنسجة السمان (QCP1) والخطوات و3،1-3،4 5،1-5،7 من البروتوكول. ويرد مثال على هذا الإجراء البديل التالي : في هذه الحالة ، علينا استخدام نفس الإجراء التجريبي كما في ألف وباء ، ولكن كنا السمان المستمدة donnor الأنسجة (كما هو موضح من خلال التعبير عن الأضداد QCPN [البني]) : إن إعادة إحياء وقد يتسبب العقدة المستمدة من الأجنة السمان التعبير عن Sox2 علامة عموم العصبية في المضيف [طبع في الفترة من 6] :

Discussion

هذا الفيديو يوضح الخطوات المختلفة في إجراء عملية فحص لتحريض العصبي ، ويستخدم هذا الاختبار أساسا لتوصيف جزيئات المفترضة تحريض العصبي في الفرخ ، وبالتالي يمكن استخدامه لمجموعة متنوعة واسعة من التطبيقات ، بدءا من micromanipulations الجنينى ^{1-4 ؛ 6} إلى شلالات جديدة كشف إشار...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eggs	Animal	Charles River Laboratories	Premium Fertile	Fertilized, HH3+ (14 hr)
Stereomicroscope	Microscope	Leica Microsystems	MZ9.5 or similar
Hybridization Incubator	Equipment	Robbins Scientific, SciGene	M1000	Use with inverted Pyrex dish and 500 ml ddH2O beaker
Marsh Automatic Incubator	Equipment	Lyon	RX
Pyrex dish
Watchmaker’s glass 50mm	Tool	VWR international	66112-060
Glass rings	Tool	Physical Plant facility		cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish.
Curved Forceps (1)	Tool	Electron Microscopy Sciences	72991-4C
Forceps (2)	Tool	Fine Science Tools	11002-13	blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil
Fine scissors	Tool	Fine Science Tools	14161-10
Plastic dishes	Tool	Falcon BD	353001
Rubber Bulb	Tool	Electron Microscopy Sciences	70980
DiI	Reagent	Invitrogen	D-282
Aspirator tube assembly	Tool	Sigma-Aldrich	A5177-5EA
Micr–lectrode puller	Equipment	Sutter Instrument Co.	Sutter InstrumentsP-97 Flaming/Brown Micropipette
Pasteur Capillary Pipette	Tool	Electron Microscopy Sciences	70950-12	round edge under flame
Culture chamber	Tool	Pioneer Plastics	030C
Microcapillary tube	Tool	Sigma-Aldrich	P1049-1PAK
Microdissecting knife	Tool	Fine Science Tools	10056-12	Use to puncture cavities prior to in situ hybridization
Minuten pins 0.2mm diam	Tool	Fine Science Tools	26002-20	Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
Diethylpyrocarbonate (depc)	Reagent	Electron Microscopy Sciences	15710
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base		Dow Corning	0001986475	Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
Diethylpyrocarbonate (depc)		Acros Organics	10025025	Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave
16% PFA		Electron Microscopy Sciences	15710