칙의 배아에서 신경 유도에 대한 분석

요약

신경 유도는 뇌의 형성의 첫 단계입니다. 그것은 Hensen의 노드 (주최자), 신경 운명을 채택할에 인접한 조직을 지시하는 메커니즘이며, 신경 계통을 일으키다하는 즉. 이 비디오는 여자의 배아에서 신경 유도에 대한 분석을 보여줍니다.

초록

여자의 난자는 초기 배아 발달의 연구에 귀중한 도구입니다. 투명성, 접근성 및 조작 용이성, 그건 신경 시스템의 형성과 초기 patterning을 공부를위한 이상적인 도구가합니다. 이 동영상은 호스트에 그래프트 구성 조직하는 방법하는 Hensen의 노드 (여자의 배아에서 주최자가) 호스트 관할 ectoderm에 이식할 수 있습니다 방법을 보여줍니다. 주최자의 수술이 신경 유도 신호를 통해 신경 운명을 채택하는 조직을하신 나 overlying 지시합니다. 이 메커니즘은 신경 유도이라고하고, amniotes의 뇌 및 척수의 형성의 초기 단계를 구성합니다. 이 메소드는 본질적으로 여자의 putative 신경 유도하는 분자의 특성에 사용됩니다. 이 동영상은 신경 유도에 대한 분석에서 여러 단계를 보여주는, 첫째, d​​onnor의 배아는 explanted과 요리에 박혀있다. 그런 다음, 호스트 배아는 새로운 문화에 대한 준비가되어 있습니다. 이식은 excised과 호스트 영역 pellucida 여백에 이식합니다. 호스트는 18-22 시간에 대한 양식입니다. 어셈블리가 고정되어 더 이상 응용 프로그램 (예에 원위치 하이브리드화)에 대한 처리됩니다. 이 방법은 원래 웨딩턴에 의해 고안되었다

프로토콜

I. 도식 개요 :

이 비디오는 여자의 배아에서 신경 유도에 대한 분석에서 여러 단계를 보여줍니다. 먼저, 호스트 배아는 새로운 문화에 explanted입니다 [NI1]. 그런 다음 donnor의 배아가 호수와 Hensen의 노드 (여자의 "구성")에 explanted됩니다 것은 형광 염료 DiI로 표시됩니다 [NI2]. Hensen의 노드가 donnor의 배아에서 excised입니다 [NI3]와 호스트 배아에 이식 [NI4, NI5]. 호스트 배아는 다음 donnor 조직 호스트 영역에서 이소성 축을 유도 가지고있는 기간이 지난 후 최대 22 시간에 대한 양식입니다 opaca [NI6]. 문화에 따라, 호스트 배아는 고정 및 DAB의 면전에서 photooxidation에 대한 처리 : DAB와 갈색 다음과 같은 반응이 될 사전 photooxidation [NI7]에 FITC의 형광 아래에 빨간색으로 나타납니다이 화학 반응, donnor 파생된 셀로 [NI8]. 배아는 다음 신경 마커 [NI8]와 현장 하이브 리다이 제이션에 대한 처리, 호스트 파생 조직 donnor 그래프트의 존재에 신경 조직을 형성 하였다. 이 조직 파란색 나타납니다.

1 : 새로운 문화에 대한 호스트의 배아를 준비

1. 이 신경 유도 분석 프로토콜 햄버거 & 해밀턴 단계 3 incubated되었습니다 계란으로 시작 ⁺ (또는 HH3 ^+). 이 계란은 13 시간 동안 습기가 인큐베이터에서 측면에 누워 incubated되었습니다.
2. 새로운 문화 (단계 3.1. 5.5 ^9)에 대한 호스트 배아를 준비합니다.
3. 200 μl 식염수에 호스트 배아의 표면을 커버. 이것은 나중에 전송 donnor 그래프트의 위치를​​ 용이하게합니다.
4. 마지막으로, 거꾸로 팰컨 35mm 문화 요리와 함께 어셈블​​리를 커버.

2 : 호수에있는 donnor의 배아를 Explanting

1. 포셉와 껍질을 두드리고있는 모든 셀 주위의 껍질 조각을 제거하여 계란을 엽니다. 껍질 위로를 제거하고 폐기.
2. 포셉와 두꺼운 알부민을 제거하고, 배가 위쪽으로 얼굴을 너무 거친 포셉로 난황을 기울.
3. 좋은 가위를 사용하여 배아 주위에 난황의 사각형 잘라. 숟가락으로 노른자에서 배아를 제거하고, PBS를 포함하는 접시에 장소.
4. 포셉를 사용하여, 지역 pellucida에서 donnor의 배아를 분리.
5. PBS를 포함 Sylgard 보상 요리로 전송 donnor의 배아.

3, 라벨링 절개 및 donnor 그래프트를 이식

1. microelectrode의 풀러를 사용하여 50 μl 유리 microcapillary pipettes를 가져옵니다. 현미경, 미세 집게를 사용하여 micropipette의 끝을 잘라. 배양 접시에있는 장소 micropipette는 plasteline의 리본으로 정렬했습니다.
2. 전에 이식에 그래프트 레이블을하는 데 사용됩니다 염료 솔루션을 준비 : 염료 DiI (1,1 '- dioctadecyl - 3, 3,3', 3' - tetramethylindocarbocyanine 퍼클로레이트) carbocyanine : 우선, 1ml에 DiI의 재고를 준비 0.5 %에서 절대 에탄올. 이 주식은 어둠 속에서 - 20C에 저장할 수 있습니다. 42 세트 물 목욕에서 ° C, 혼합 360μl 0.3M 자당 40 μl DiI 주식을 prewarmed. 물 목욕 온도가 DiI과 불용성 결정 형성의 침전을 방지하기 위해 필요합니다. 간단히 미니 spectrafuge에 솔루션을 (5-10 초 동안) 스핀. DiI 솔루션은 이제 사용할 준비가되었습니다.
3. 곤충 핀을 사용하여 Sylgard 적용 접시의 바닥에있는 donnor의 배아를 확보.
4. 백 - 채우기 DiI로 micropipette합니다. 흡인기 튜브 어셈블리를 사용하여 부드러운 압력을 적용하여, Hensen의 노드에 DiI의 작은 볼러스를 적용합니다. 전체 Hensen의 노드가 표시되었는지 확인합니다.
5. microcapillary 피펫 또는 microdissecting 칼을 사용 Hensen의 노드를 ( "주최자"donnor 그래프트) 컷.
6. 복부 측면과 카마인과 이식의 사후 끝을 표시합니다. 이것은 이식이 단계에서 적절한 dorso 4.3 - 복부 방향과 위치 있는지 확인합니다.
7. 200μl 길슨 피펫을 사용하여 호스트 배아에 이식을 전송하기만하면됩니다.

4 : 이식 및 culturing 호스트 배아를 확보

1. 그래프트 호스트 사이트 근접 위치에 남아 있는지 확인하고, 호스트 배아에서 염분 제거합니다.
2. microcapillary 피펫 또는 microdissecting 나이프를 사용하여 호스트 배아의 Hensen의 노드의 수준, 지역 pellucida / 지역 opaca 경계 영역에 작은 절개 (80 - 100μm)을합니다.
3. 그 복부 측면 당신과 사후 최종 향해 얼굴 있도록 microcapillary 피펫 또는 microdissecting 나이프, 위치 그래프트를 사용하면 호스트 배아에 상응하는 지역에 평행이다.
4. 남은 생리를 제거하고, 81-22 시간 (단계 6.1 6.6 ^9)에 대한 새로운 문화에 대한 호스트 배아를 처리합니다.
5. 호스트 배아는 다음 4 ° C (단계 7.1-7.7 ^9)에서 하룻밤 고정됩니다.

E "> 5 : 형광 아래 그래프트를 Photooxidise

1. 펌 후드 아래, 트리스 버퍼에 DAB 작업 솔루션을 준비 : 500μg/ml에서 트리스 버퍼 (100mM 트리스 - HCL, pH를 7.4)에서 (3,3 '- diaminobenzidine의 tetrahydrochloride) DAB 기판을 디졸브, 얼음, 어두운 솔루션을 유지.
2. 트리스 버퍼의 각 한 번 5 MN 5 MN에 대한 두 번 PBS에서 배아를 씻으십시오.
3. 1 ML 트리스 버퍼를 포함하고있는 유리 슬라이드 캐비티에 배아를 전송합니다.
4. 1.5 ML DAB 솔루션 트리스 버퍼 솔루션을 교체합니다. DAB를 오염을 제거하다하기 위해 10 % 표백 용액이 들어있는 양동이에 Eppendorf 끝 처리. 공동 슬라이드 위에 coverslip 놓으십시오.
5. FITC (플루오레신 isothiocyanate) 형광 아래 그래프트 (donnor 세포가 형광 빨간색으로 나타납니다)에있는 현미경의 목표를 집중하고 모든 형광 붉은 세포가 갈색 (이것은 DiI의 결과로 발생 될 때까지 FITC의 형광에 노출될 photoconverted되는 fluorochrome 불용성 갈색 결정하기 위해, DAB의 면전에서 FITC 여기 파장 (488nm)에 적용됩니다. 노출에 의해이 과정은 20 MN 2 시간 사이에 걸립니다.
6. photooxidation 반응의 완료에 따라, 미세 집게를 사용하여 coverslip을 제거합니다. 유리 PBTw (또는 0.1 % 트윈 - 20와 함께 PBS)가 포함된 20 ML의 섬광 병을를 배아를 전송합니다.
7. 10 % 표백 용액에 잠복기로 coverslip 유리 캐비티 슬라이드에서 DAB를 비활성화합니다.

6 : 현장 하이브리드화, 사진에 대한 배아를 처리하고 sectioning

1. 전용 라벨 프로브를 발굴을위한 배아를 잠복기, 현장 하이브리드화 (단계 3.7 6.5 ^9)에서 진행합니다.
2. 사진 촬영 (8.2 ⁹ 단계) 및 (단계 8.3 및 8.4 ⁹⁾ sectioning 진행합니다.

대표 결과

신경 유도 분석의 다음 예제에서는 donnor 그래프트는 호스트 파생 조직에서 신경 마커 꼬리가없는의 표현을 유도 표시됩니다. donnor 그래프트는 "주최자"영역이 수술 단계에서 donnor의 배아에서 제거되었습니다있는 배아 유래 :이 특정 예제에서, 우리는 일반적으로 "주최자"능력이없는 배아 영역의 신경 유도하는 능력의 획득을 평가 3 ^+. 구멍 치유하고 Hensen의 노드를 닮은 구조가 형성 때까지 절제 따라 donnor의 배아는 새로운 문화의 개발을 허용합니다. 이 구조는 다음 DiI로 표시된 donnor의 배아에서 excised 및 호스트 배아 면적 pellucida / 지역 opaca 경계에 이식할 수 있습니다. 새로운 문화에 따라, 미니어처 축이 호스트 배아에 인접한 형성이 미니어처 축 붉은 세포의 막대 (donnor는 파생)와 머리처럼 구조 (호스트 파생)의 구성에서 (A), donnor - 파생 DiI 분류 전지는 FITC 형광 현미경 하에서 이전에 고정으로 표시됩니다. 이러한 donnor - 유래 세포는 붉은 세포의 막대로 표시 미니 notochord를 형성 확산있다. (B) DiI의 다음 photoconversion,이 donnor - 유래 세포는 갈색 나타납니다. donnor 그래프트는 호스트에서 신경 조직의 형성을 유도했다 :이 조직은 뇌를 엽 성의 전구 물질로 구성되어 등 현장 하이브리드화에 마커 꼬리가없는 다음과 같은 그들의 표현에 의해 공개 [6에서 reprinted].

참고 :이 절차에서는, 우리는 "신경"조직 (파란색) 파생 호스트에서 신경 유도 donnor 조직 (레드 / 브라운)을 차별화하기 위해 DiI 레이블 세포를 사용했습니다. 대신 파생 여자, DiI 표시 donnor 그래프트를 사용하는 일부 작가도 아닌 여자의 메추라기 배아에서 파생된 donnor 조직 [예 6].를 사용하여 이 대체 방법은 호스트 조직에서 donnor을 차별화 할 수 있습니다. 이 경우, 그래프트 (donnor 조직) 대신 닭고기 계란의 메추라기 계란에서 유래. 4.5 단계에 따라, 호스트가 5.7-3.4와 5.1 조직 (QCP1)와 단계 3.1 퀘일 특정 항체와 함께 전체 마운트 immunohistochemistry에 대한 처리는 프로토콜에서 생략됩니다. 이 대안 절차의 예제는 아래와 같습니다 :이 경우에는, (같은 QCPN 항체 [갈색]의 표현에 의해 참조) 우리는 A, B에서 같은 실험 절차를 사용하지만 우리는 퀘일 - 파생 donnor 조직을 사용 : 재생 메추라기 배아에서 파생 노드는 호스트에있는 냄비 - 신경 마커 Sox2의 표현을 유도했다 [6에서 reprinted]

토론

이 동영상은 신경 유도에 대한 분석을 수행하는 다른 단계를 설명합니다,이 분석은 본질적으로 여자의 putative 신경 유도하는 분자의 특성에 사용되며, 따라서 embryological micromanipulations ^1-4을 이르기까지 애플 리케이션의 다양한 사용할 수 ^{있습니다; 6} 무너지고 새로운 신호 폭포로 ^7,8 모든 두뇌 형성하고 남은 신경 계통의 초기 단계에 대한 이해를 목표로.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eggs	Animal	Charles River Laboratories	Premium Fertile	Fertilized, HH3+ (14 hr)
Stereomicroscope	Microscope	Leica Microsystems	MZ9.5 or similar
Hybridization Incubator	Equipment	Robbins Scientific, SciGene	M1000	Use with inverted Pyrex dish and 500 ml ddH2O beaker
Marsh Automatic Incubator	Equipment	Lyon	RX
Pyrex dish
Watchmaker’s glass 50mm	Tool	VWR international	66112-060
Glass rings	Tool	Physical Plant facility		cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish.
Curved Forceps (1)	Tool	Electron Microscopy Sciences	72991-4C
Forceps (2)	Tool	Fine Science Tools	11002-13	blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil
Fine scissors	Tool	Fine Science Tools	14161-10
Plastic dishes	Tool	Falcon BD	353001
Rubber Bulb	Tool	Electron Microscopy Sciences	70980
DiI	Reagent	Invitrogen	D-282
Aspirator tube assembly	Tool	Sigma-Aldrich	A5177-5EA
Micr–lectrode puller	Equipment	Sutter Instrument Co.	Sutter InstrumentsP-97 Flaming/Brown Micropipette
Pasteur Capillary Pipette	Tool	Electron Microscopy Sciences	70950-12	round edge under flame
Culture chamber	Tool	Pioneer Plastics	030C
Microcapillary tube	Tool	Sigma-Aldrich	P1049-1PAK
Microdissecting knife	Tool	Fine Science Tools	10056-12	Use to puncture cavities prior to in situ hybridization
Minuten pins 0.2mm diam	Tool	Fine Science Tools	26002-20	Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
Diethylpyrocarbonate (depc)	Reagent	Electron Microscopy Sciences	15710
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base		Dow Corning	0001986475	Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
Diethylpyrocarbonate (depc)		Acros Organics	10025025	Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave
16% PFA		Electron Microscopy Sciences	15710