سريع والحساسة صمغي Coomassie G - 250 لتلطيخ البروتينات في الهلام بولي أكريلاميد

Summary

يجب نشر هذا الفيديو الغروية Coomassie a G - 250 وفقا لبروتوكول تلطيخ كانغ وآخرون. للكشف عن البروتين متوسط ​​4 نانوغرام في المواد الهلامية. اكتمال التلوين في حدود 2 ساعة ، ودون أي جهد. نستخدم عادة بروتوكول كانغ للأغراض التحليلية في جل المستندة البروتيوميات.

Abstract

Coomassie بريليانت الأزرق (المصرف المركزي) هو صبغ يشيع استخدامها لتصور للبروتينات مفصولة SDS - PAGE ، وتقدم على إجراء تلوين بسيطة والكميات العالية. وعلاوة على ذلك ، وهو متوافق تماما مع الكتلة الطيفي تحديد البروتين. لكن على الرغم من هذه المزايا ، يعتبر المصرف المركزي إلى أن تكون أقل حساسية من الفضة أو stainings مضان ، وبالتالي نادرا ما تستخدم للكشف عن البروتينات في النهج التحليلي القائم على البروتين هلام.

أدخلت تحسينات عديدة من ¹ أصلية Coomassie بروتوكول لزيادة حساسية المصرف المركزي. تطبيق Neuhoff وزملاؤه في عام 1988 ، والميثانول بنسبة 20 ٪ وتركيزات أعلى من كبريتات الامونيوم في G - 250 المصرف المركزي حل يستند تلطيخ ² : أدخلت تعديلين رئيسية لتعزيز الكشف عن البروتينات المنخفضة وفيرة عن طريق تحويل الجزيئات إلى جزيئات صبغة الغروية وفي عام 2004 آخرون Candiano. أنشئ المصرف المركزي باستخدام الأزرق الفضي G - 250 مع حامض الفوسفوريك في وجود كبريتات الامونيوم والميثانول ^3. ومع ذلك ، فإن جميع هذه التعديلات تسمح فقط للكشف عن البروتين حوالي 10 نانوغرام. ونشرت على نطاق واسع لبروتوكول fameless تلطيخ Coomassie الغروية التي كانغ وآخرون في عام 2002 حيث تعديل Neuhoff تلوين المصرف المركزي الغروية بروتوكول بشأن المواد complexing. بدلا من كبريتات الامونيوم سلفات الألمنيوم استخدامها واستعيض الميثانول من ⁴ الإيثانول أقل سمية. وأظهرت القائمة على الألمنيوم في دراسة الرواية تلوين كانغ الحساسية الفائقة التي يكشف منخفضة مثل 1 نانوغرام / فرقة (فسفوريلاز ب) مع قليل من الاختلاف حساسية اعتمادا على البروتينات.

هنا ، علينا أن نظهر تطبيق بروتوكول كانغ لسريع وحساسة تلطيخ Coomassie الغروية من البروتينات في أغراض التحليلية. وسوف نوضح بروتوكول سريعة وسهلة باستخدام ثنائية الأبعاد المواد الهلامية بصورة روتينية في مجموعتنا العمل.

Protocol

الجزء 1 : ثنائي الأبعاد الكهربائي للهلام (2 - D) باستخدام كوب التحميل

1. IPG - الشريط الإماهة والتركيز كهرساوي (IEF)
   • ترطيب المواد الهلامية DryStrip Immobiline ، ودرجة الحموضة 6-11 (7 سم) في 125 حل الإماهة ميكرولتر [7 M اليوريا ، 2 M ثيويوريا ، الفصلان 4 ٪ ، و 50 ملم وhydroxyethyldisulfide 2 ٪ IPG الحموضة الاحتياطي 11/06] باستخدام Immobiline صينية لDryStrip Reswelling لا يقل عن 10 ساعة.
   • حل عجل عينة البروتين في عينة العازلة IEF [7 M اليوريا ، 2 M ثيويوريا ، الفصلان 2 ٪ و 2 ٪ ASB - 14 ، hydroxyethyldisulfide 50 ملم و 2 ٪ IPG الحموضة الاحتياطي 11/06] بروتين الموافق 6-10 ميكروغرام لكل 100 ميكرولتر .
   • بعد solubilization (على الأقل 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة) ، وتطبيق نموذج البروتين عبر انوديك كأس الكؤوس التحميل باستخدام عينة. حجم الكوب هو 100 ميكرولتر (كوب المنوع سماح تصل إلى 150 ميكرولتر).
     ملاحظة : يمكنك تحميل كميات أكبر عينة إذا قمت بإدراج خطوة ذات الجهد المنخفض في بداية البروتوكول التركيز وإعادة ملء أكواب في حين لا يزال هناك فيلم السائل في الكوب!
   • التركيز على أداء كهرساوي kVh 11.1 في وضع التدرج في الكهربائي Multiphor الوحدة الثانية.
2. موازنة وSDS PAGE -
   • بعد IEF ، تعرض شرائط IPG للحد من وألكلة ، في كل مرة 15 دقيقة على شاكر ، وذلك باستخدام dithiothreitol 1 ٪ و 2.5 ٪ على التوالي iodoacetamide في حل موازنة [50 ملي Tris-HCl/pH 8.8 ، 6 M اليوريا والجلسرين 30 ٪ و 2 ٪ SDS].
   • شطف شرائح معايرتها مع H ₂ O وصمة عار لهم على الورق لإزالة الزائدة whatman موازنة العازلة. بعد ذلك تراجع الشرائط في SDS الامد العازلة (1X).
   • يتم تنفيذ البعد الثاني بواسطة SDS - PAGE على النظم العمودي الكهربائي مع تركيز مادة الأكريلاميد ما مجموعه 12 ٪. وضعت شرائط IPG معايرتها على الجزء العلوي من المواد الهلامية التي تفصل وثابتة مع الحل agarose الساخنة [agarose 0.5 ٪ في تشغيل العازلة التي تحتوي على الأزرق bromophenol].
   • تم فصل البروتينات لمدة 2.5 ساعة ، ابتداء من الساعة 80 V لمدة 15 دقيقة تليها حتى 120 فولت الجبهة صبغ يصل الجزء السفلي من الكاسيت هلام.

الجزء 2 : صمغي Coomassie تلطيخ مع المصرف المركزي G - 250

1. تلطيخ حلول
ملاحظة : لإعداد الحلول التلوين ، واستخدام المواد الكيميائية ذات جودة عالية مثل الصف تحليلية (سنويا) والمياه عالية النقاء كما تحصل من أنظمة ميليبور (الملة - Q الماء).

Coomassie الحل :		2000 م مل H 2 O
0.02 ٪ ث (/ V)	المصرف المركزي G - 250	0،4 ز
5 ٪ (W / V)	كبريتات الالومنيوم (14-18) هيدرات	100 غرام
10 ٪ (V / V)	الإيثانول (96 ٪)	200 مل
2 ٪ (V / V)	حمض orthophosphoric (85 ٪)	47 مل

ملاحظة : لإعداد الحل تلوين ، إضافة متسلسلة من المكونات الموجودة في الترتيب التالي لابد من المحافظة :

1. حل first كبريتات الألمنيوم في الملة - Q المياه
2. بعد ذلك إضافة الإيثانول ، التجانس ، ومزيج المصرف المركزي G - 250 إلى الحل
3. في الآونة الأخيرة كما يذوب تماما الحل ، إضافة حامض الفوسفوريك (دمج الحامض إلى وسائل الإعلام الكحولية يتيح للجزيئات Coomassie الكلي في دولتهم الغروية)
4. شغل أخيرا مع الملة - Q المياه

ملاحظة : الحل النهائي وتلطيخ مظلم الاخضر المزرق ومظهر ممتلئ من الجسيمات السباحة حول ما يلي :

• لا رشاحة هذا الحل!
• إذا قمت بتغيير النظام من الإعداد ، سوف تحصل على حل أكثر البنفسجي المزرق الذي هو أقل حساسية.

Destaining الحل :		2000 م مل H 2 O
10 ٪ (V / V)	الإيثانول (96 ٪)	200 مل
2 ٪ (V / V)	حمض orthophosphoric (85 ٪)	47 مل

2. تلطيخ الداخلي

• بعد انفصال البعد الثاني ، وإزالة المواد الهلامية بعناية من لوحات الزجاج ونقلها الى صحن مليء تلطيخ الملة - Q المياه.
• غسل المواد الهلامية ثلاث مرات مع الملة - Q الماء لمدة 10 دقيقة على شاكر الأفقي (غسل أسباب حساسية كافية لأن الفقراء SDS المتبقية على المواد الهلامية يزعج المحيط للصبغ للبروتين).
• هزة الحل Coomassie قبل الاستخدام لتفريق الجسيمات الغروية بالتساوي.
• احتضان والمواد الهلامية بتغطية جيدة مع الحل Coomassie بواسطة التحريض على شاكر ل12/02 ساعة. هذا يولد تلوين الخلفية الهامشية بحيث يمكنك مراقبة التقدم المحرز في تلطيخ بينهما.
  ملاحظة : بعد 10 دقيقة يمكن أن تشاهد بقع البروتين تظهر للمرة الاولى ، في حدود 2 ساعة من الحضانة حوالي 80 ٪ تلطيخ إليهااكتمال ق أقصى مستوى. لتلطيخ ما يقرب من 100 ٪ ، فمن المستحسن الحضانة بين عشية وضحاها. في بعض الحالات ، عندما كمية من البروتين ليكون ملون ضخم والحل يتحول إلى زرقاء لامعة ، والتحديث من الحل تلطيخ ضروري.
• بعد هذا الإجراء إزالة البقع الحل Coomassie وشطف الهلام مرتين مع الملة - Q المياه.
  ملاحظة : يمكنك إعادة تلوين الحل طالما الجزيئات التي لا تزال قائمة ، وإلا فإنه تجاهل (نضع في اعتبارنا أن المختبر الخاص قد يكون لها لوائح خاصة للتخلص من النفايات).
• إزالة الجسيمات العالقة صبغة تلوين من الطبق مع خالية من الوبر منشفة ورقية ويزيل اللون لمدة 10 -- 60 دقيقة.
  ملاحظة : يمكنك أيضا غسل المواد الهلامية فقط مع الملة - Q المياه ولكن هذا نوصي فقط عن المواد الهلامية التحضيرية سوف تستمر لأن هناك غير منتظمة ، والأفلام Coomassie ضعيف على المواد الهلامية التي سوف تنشأ أثناء إجراء المسح.
• أخيرا شطف الهلام مرتين مع الملة - Q المياه : سوف يصل سمك الهلام الأصلي (وسائل الإعلام الكحول والحامض يجعل تقلص المواد الهلامية) ، وتحييد في المياه بالإضافة إلى ذلك يعزز من كثافة Coomassie اللون.

الجزء 3 : نتائج الممثل

اذا كنت تتبع البروتوكول المذكورة أعلاه سوف تحصل على جهاز D - 2 الجل الملون وكذلك حل الظلام المميزة البقع الزرقاء البروتين. حتى بالمقارنة مع هلام 2 - D ملطخة الفضة وفقا لآخرون شيفتشينكو ⁵ ، بروتوكول يدعي حساسية جيدة والتوافق مع مطياف الكتلة ، أن نحقق نتائج تلطيخ متساوية.

الشكل 1 : النتائج النهائية للتجارب المذكورة أعلاه. كانغ Coomassie البروتوكول (أ) ينفذ بقوة مثل الفضة وفقا لتلطيخ آخرون شيفتشينكو (B) في الكشف عن البروتينات بعد 2 - D هلام إستشراد.

الجزء 4 : نصائح والخدع

• أداء بعض stainings اختبار قبل معالجة العينات الخاصة بك. غير قابل للتفسير لأسباب ذكرت في بعض الأحيان نحن لا يمكن أن بروتين يتم الكشف عن الاهتمام بنجاح حتى عندما طبقت ملليغرام. في هذه الحالة نوصي لإعداد سلسلة تخفيف بعض لاختبار الحساسية.
• إذا كان لديك منخفضة في جل اكتشاف بروتين (ق) في نقل عامة ناجحة من التراص إلى هلام خلال فصل SDS - PAGE ربما يكون السبب. يمكنك الاختيار لزجة مثل البروتينات التي تلطيخ الجل كاملة بما في ذلك منطقة التراص.
• عن التحقق من النتائج بسرعة تساوي الكهربية الخاص مع التركيز ، يمكنك صمة مباشرة شرائط IPG من دون أي فصل البعد الثاني أخرى.
• بدوره أحيانا المواد الهلامية أثناء الإجراء بحيث يتم تلوين ملطخة أنها بالتساوي من كلا الجانبين (إذا كنت تحتفظ المواد الهلامية غير متأثر ، وصبغ يربط فقط لجانب واحد من هلام).
• شهدنا أن تخزين الحل تلطيخ في زجاجة داكنة يزيد من عمر البطارية (في زجاجات شفافة تصل إلى 4 أشهر).
• بعد التلوين وتوثيق تتمكن من الحفاظ على المواد الهلامية في الثلاجة لعدة سنوات (إذا قمت بإضافة المحاليل الحمضية يمكنك تجنب التلوث بواسطة الفطريات).
• يمكن التعجيل Destaining من المقابس هلام لهضم تريبسيني عن الاحترار في سخان كتلة.

Discussion

الابتكارية أو مجرد بروتوكول Coomassie؟

في هذه اللحظة توجد بروتوكولات متعددة لتلطيخ الاجراءات مع Coomassie بريليانت الأزرق. معظمهم نتيجة تعديلات طفيفة أو كبيرة واحدة من البروتوكولات الأكثر استخداما من قبل الزملاء وNeuhoff ^2. أيضا بروت?...

Materials

اسم المنتج	شركة	رقم كتالوج	تعليقات
لمنتدى الطاقة الدولي وSDS PAGE - :
Immobiline DryStrip المواد الهلامية	جنرال إلكتريك للرعاية الصحية	17-6001-94	ويمكن أن تستخدم حتى 2 سنوات بعد تاريخ انتهاء صلاحية.
Immobiline صينية DryStrip Reswelling	جنرال إلكتريك للرعاية الصحية	80-6371-84	لا نظيفة مع المذيبات العضوية. المصممة لشرائح IPG 7-18 سم.
Immobiline DryStrip كيت	جنرال إلكتريك للرعاية الصحية	18-1004-30	وتشمل علبة ، حامل القطب ، الأنود والكاثود الأقطاب ، وعينة اليجنر شريط كأس الكؤوس والعينة.
EPS الطاقة XL 3501 التموين	جنرال إلكتريك للرعاية الصحية	18-1130-05	إمدادات التيار الكهربائي يصل الى 3500 V.
Multiphor الوحدة الثانية الكهربائي	جنرال إلكتريك للرعاية الصحية	18-1018-06	الأقطاب الكهربائية المنقولة IEF في تمكين جميع شرائح IPG طول (24/07 سم IPG شرائط)
PerfectBlue هلام نظام التوأم S	Peqlab	45-1010 - C	SDS - PAGE في تنسيق مصغرة 10x10 سم هلام. هلام غرفة يتضمن نظام التبريد.
لتلطيخ الغروية Coomassie G - 250 :
تلوين الأطباق مع اغطية	VWR	216-3412	ليناسب مصغرة المواد الهلامية. تكويم على شاكر.
كبريتات الالومنيوم - 18 - هيدرات	ميرك	1.01102.5000	قدمنا ​​أفضل تجربة مع شركة ميرك. متاح فقط في حزمة 5 كغم.
orthophosphoric حمض	Prolabo	20 624.295	تباع في قوارير زجاجية.