Polyacrylamide의 젤의 단백질에 대한 신속하고 민감한 콜로이드 쿠매시 G - 250 스테 이닝

요약

이 동영상은 강호에 따라 콜로이드 쿠매시 G - 250 얼룩 프로토콜을 대중화한다 외. 젤 평균 4 NG 단백질의 검출을위한. 얼룩은 2 시간 이내에 어떠한 노력도없이 ​​완료됩니다. 우리는 일상적으로 젤 기반 proteomics의 분석을 위해 강호의 프로토콜을 사용합니다.

초록

쿠매시 블리언트 블루 (CBB)은 일반적으로 간단한 얼룩 절차 및 높은 quantitation를 제공 SDS - PAGE로 구분하여 단백질의 시각화에 사용되는 염료입니다. 또한, 그것은 대량 spectrometric 단백질 식별와 완벽하게 호환됩니다. 그러나 이러한 장점에도 불구하고, CBB는 은색 또는 형광 stainings보다 민감하고 따라서 분석 젤 기반 proteomic 접근에서 단백질의 검출에 사용되는 거의 없습니다 것으로 간주된다.

원래 쿠매시 프로토콜 ¹ 몇 가지 개선 CBB의 감도를 증가되었습니다. 두 대대적인 개조가 콜로이드 입자로 염료 분자를 변환하여 낮은 풍부한 단백질의 검출을 향상시키기 위해 도입되었습니다 : 1988 년, Neuhoff와 동료는 CBB G - 250을 기반으로 얼룩 솔루션 ^2에 20 % 메탄올 및 암모늄 황산의 높은 농도를 적용 2004 Candiano 외 인치 암모늄 황산과 메탄올 ^3의 존재에있는 인산과 CBB G - 250을 사용하여 블루 실버를 설립하였습니다. 그럼에도 불구하고, 모든 수정은 약 10 NG 단백질의 검출을 허용합니다. 콜로이드 쿠매시의 얼룩에 대해 광범위하게 fameless 프로토콜은 강 외에 의해 출판되었다. 2002 년 그들은 complexing 물질에 관한 Neuhoff의 콜로이드 CBB의 얼룩 프로토콜을 수정 곳. 대신 암모늄 황산의 그들은 황산 알루미늄과 메탄올이 적은 독성 에탄올 ^4로 대체되었다를 사용합니다. 소설 알루미늄 기반의 강호의 연구에 얼룩이 약간 감도 유사 단백질에 따라 1 NG / 밴드 (phosphorylase B)처럼 낮은 감지 우수한 감도를 보여주었다.

여기서는 분석 목적에 단백질의 신속하고 민감한 콜로이드 쿠매시의 얼룩을 위해 강호의 프로토콜의 응용 프로그램을 보여줍니다. 우리는 일상적으로 우리의 작업 그룹에서 수행 2 차원 젤을 사용하여 빠르고 쉽게 프로토콜을 설명합니다.

프로토콜

1 부 : 컵 로딩을 사용하여 2 차원 (2 - D) 겔 전기 영동

1. IPG - 스트립 rehydration과 isoelectric 초점 (IEF)
   • 125 μl rehydration 솔루션의 Immobiline의 DryStrip의 젤, 산도 6-11을 (7cm) Rehydrate [7 M 우레아, 2 M 티오 우레아, 4 % 챕스, 버퍼 산도 6-11을 IPG 50 MM의 hydroxyethyldisulfide 2 %]에 대한 Immobiline DryStrip Reswelling 트레이를 사용하여 적어도 10 시간.
   • IEF 샘플 버퍼 시켰던 단백질 샘플을 디졸브 [7 M 우레아, 2 M 티오 우레아, 2 % 챕스, 2% 버퍼 산도 6-11 IPG ASB - 14, 50 MM의 hydroxyethyldisulfide 2 %] 100 μl 당 60-100 μg의 단백질에 대응을 .
   • solubilization (상온에서 최소 30 분) 후, 샘플 컵을 사용하여 컵 로딩 양극을 통해 단백질 샘플을 적용합니다. 컵의 볼륨은 100 μl입니다 (매니폴드 컵 150 μl까지 허용).
     참고 : 컵에 액체 필름 아직 거기있는 동안 당신이 초점을 프로토콜과 리필 종이컵의 시작 부분에서 낮은 전압 단계를 삽입하는 경우가 더 큰 예제 금액을 로드할 수 있습니다!
   • Multiphor II 전기 영동 단위의 기울기 모드에서 11.1 kVh에 대한 초점을 isoelectric을 수행합니다.
2. 평균 및 SDS - PAGE
   • IEF 후, I​​PG 스트립은 평균 솔루션에 각각 1 % dithiothreitol과 2.5 %의 iodoacetamide를 사용하여 쉐이크에 대한 때마다, 감소와 알킬화 15 분 대상이되었다 [50 MM Tris-HCl/pH 8.8, 6 M 우레아, 30 % 글리세롤 그리고 2% SDS].
   • H ₂ O와 equilibrated 스트립을 씻어 초과 평형의 버퍼를 제거하는 왓먼 종이에 그들을 얼룩. 이후 SDS 실행 버퍼 (1X)에 부착된을 찍어.
   • 두 번째 차원은 12 %의 총 아크릴 아미드의 농도와 수직 전기 영동 시스템에 대한 SDS - PAGE에 의해 수행됩니다. equilibrated IPG 스트립이 분리 젤의 상단에 위치하고 뜨거운 아가로 오스 솔루션 [bromophenol 블루가 포함된 버퍼 실행에 0.5 % 아가로 오스]를 함께 해결되었습니다.
   • 단백질은 염료 전면 겔 카세트의 바닥에 도달할 때까지 120 V 다음에 15 분 동안 80 V에서 시작, 2.5 시간을 위해 분리되었다.

2 부 : CBB G - 250로 콜로이드 쿠매시의 염색법

1. 얼룩 솔루션
참고 : Millipore 시스템 (밀리 Q 물)에서 얻을로 얼룩 솔루션의 준비를 위해 이러한 분석 학년 (PA) 및 고순도의 물 같은 높은 품질의 화학 물질을 사용합니다.

쿠매시 솔루션 :		광고 2000 ML H 2 O
0.02 % (W / V)	CBB G - 250	0,4 g
5 % (W / V)	황산 알루미늄 - (14-18) 수화물	100g
10 % (V / V)	에탄올 (96 %)	200 ML
2퍼센트 (V / V)	orthophosphoric 수 소산​​ (85 ​​%)	47 ML

참고 : 얼룩 솔루션의 준비를 위해, 다음과 같은 순서로 구성 요소의 연속적인 덧셈 유지되어야합니다 :

1. 첫째 밀리 Q 물에 황산 알루미늄을 풀다
2. 이후, 에탄올을 추가 균질하고 솔루션에 CBB G - 250 믹스
3. 솔루션이 완전히 해소에 버금가는 최근, 인산을 (알코올 미디어 산성의 결합들은 콜로이드 상태로 집계 쿠매시 분자를 수) 추가
4. 결국 밀리 Q의 물을 채워

참고 : 최종 얼룩 솔루션은 어두운 녹색 푸른빛이 도는 모양을 가지고 있으며, 주변에 수영 입자 가득합니다 :

• 여과액이 솔루션은하지 마!
• 이 준비의 순서를 변경하는 경우, 당신은 덜 민감보다 바이올렛 - 푸르스름한 솔루션을 얻을 것입니다.

솔루션을 Destaining :		광고 2000 ML H 2 O
10 % (V / V)	에탄올 (96 %)	200 ML
2퍼센트 (V / V)	orthophosphoric 수 소산​​ (85 ​​%)	47 ML

2. 절차를 염색법

• 두번째 차원 분리 후, 조심스럽게 유리 접시에서 젤류를 제거하고 밀리 Q 물로 가득 얼룩 그릇에 그들을 전송합니다.
• 수평 흔드는 (젤에 남아있는 SDS는 단백질에 대한 염료의 경계를 방해하기 때문에 부족한 세탁은 가난한 감도의 원인)에 10 분간 밀리 Q 물로 젤 세 번 씻으십시오.
• 고르게 콜로이드 입자를 분산하는 데 사용하기 전에 쿠매시 솔루션을 흔들어.
• 잘 2~12시간 위해 쉐이크에 교반하여 쿠매시 솔루션으로 덮여 젤을 품어. 이 사이에있는 얼룩의 진행 상황을 볼 수 있도록이 얼룩은 한계 배경을 생성합니다.
  참고 : 10 분 후 먼저 단백질의 명소가 부화 2 시간 이내에, 그것에 얼룩 약 80 %를 게재 볼 수 있습니다S 최대 레벨이 완료됩니다. 거의 100 % 얼룩 경우, 하룻밤 배양하는 것이 좋습니다. 어떤 경우에는 스테인드하는 단백질의 양이 거대하며 솔루션은 밝은 청색으로 변하기 때, 얼룩 솔루션의 새로 고침이 필요합니다.
• 얼룩 절차 후 쿠매시 솔루션을 제거하고 밀리 Q 물로 두 번 젤을 씻어.
  참고 : 입자가 아직 남아 있으므로이 한 얼룩 솔루션을 재사 용할 수, 그렇지 않으면 (귀하의 연구실은 폐기물 처리에 대한 특별한 규정이있을 수 있습니다 것을 명심하십시오)를 폐기하십시오.
• 보푸라기가없는 종이 타월로 얼룩 접시에서 염료 입자를 집어넣는 제거하고 10 destain - 60 분.
  참고 : 또한 단지 밀리 Q 물로 젤을 씻을 수 있지만 스캔 절차를 수행하는 동안 발생할 것입니다 젤에 불규칙적인, 약한 쿠매시 필름이 지난 있기 때문에 이것은 우리가 예비 젤에 대해서만하는 것이 좋습니다.
• 마지막으로 밀리 Q 물로 두 번 씻어 젤 : 젤 원래 두께에 도달 (알코올 산성 미디어 젤의 축소를 만드는)와 중화 물 속에서 또한 쿠매시의 색상 강도를 향상됩니다.

파트 3 : 대표 결과

당신은 위에서 설명한 프로토콜을 따른다면 당신은 2 - D 젤 특유의 해결을 잘 스테인드 진한 파란색 단백질 명소에 얻을 것이다. 심지어 쉐브첸코 외. ^5, 질량 분광법과 좋은 감도와 호환성을 주장하는 프로토콜에 따라 은색 물들일 2 - D 겔에 비해, 우리는 동등한 얼룩 결과를 얻을 수 있습니다.

그림 1 : 위에서 설명한 실험의 최종 결과. 강의 쿠매시 프로토콜 (A)는 쉐브첸코 외에 따라 은빛 얼룩처럼 강력하게 수행합니다. (B) 2 - D 겔 전기 영동 후 단백질을 검출 인치

부 4 : 팁 및 유용한 정보

• 자신의 샘플을 처리하기 전에 몇 가지 테스트 stainings을 수행합니다. 설명할 이유로 우리는 밀리그램이 적용되었습니다 때에도 관심의 단백질이 성공적으로 감지되지 않을 수 가끔 보도했다. 이 경우에는 우리는 감도를 테스트하는 몇 가지 희석 시리즈를 준비하는 것이 좋습니다.
• 당신은 SDS - PAGE 동안 분리 겔에 스태킹에서 일반적으로 실패 전송의 단백질 인 겔 감지 (들)을 낮은이있다면 아마도 그 이유 것입니다. 당신은 스태킹 지역을 포함한 전체 젤 얼룩하여 이러한 끈적끈적한 단백질에 대한 확인하실 수 있습니다.
• 귀하의 isoelectric 초점 결과의 빠른 확인을 위해, 당신은 바로 더 둘째 차원 분리하지 않고 IPG - 스트립을 얼룩 수 있습니다.
• 그들은 (당신이 젤은 냉정한 유지하면 염료 그냥 젤의 한쪽에 바인딩) 양쪽에서 균등하게 스테인드하므로 때때로 얼룩 절차를 수행하는 동안 젤을 켜십시오.
• 우리는 그 어두운 병에 얼룩 솔루션 스토리지 (4 개월 최대 투명 병에)의 수명을 증가가 발생했습니다.
• 얼룩 및 (가 산성 솔루션을 추가하는 경우가 곰팡이에 의해 contaminations을 피할) 몇 년 동안 냉장고에 젤을 유지할 수 문서화 후.
• tryptic 다이제스트에 대한 겔 플러그의 Destaining은 블록 히터의 온난화에 의해 가속 수 있습니다.

토론

혁신 아니면 그냥 다른 쿠매시 프로토콜?

현재 쿠매시 브릴리언트 블루와 절차를 얼룩에 대해 여러 개의 프로토콜이 존재. 그들의 대부분은 Neuhoff 및 동료 ^2에서 가장 일반적으로 사용되는 프로토콜 중 하나의 미성년자 또는 대대적인 개조로 인한. 또한 강의 프로토콜은 Neuhoff의 공식에 따라. 하지만 정말 proteomic 연구에 대안 쿠매시의 얼룩 방법인가요? 우리는 다른 ?...

자료

제품 이름	회사	카탈로그 번호	댓글
: IEF와 SDS - PAGE에 대한
Immobiline DryStrip 젤	GE 헬스케어	17-6001-94	심지어 날짜 만료 2 년후 사용할 수 있습니다.
Immobiline DryStrip Reswelling 트레이	GE 헬스케어	80-6371-84	유기 용제와 함께 세척하지 마십시오. 7-18센티미터 IPG - 부착된를 위해 마련되었습니다.
Immobiline DryStrip 키트	GE 헬스케어	18-1004-30	트레이, 전극 홀더, 양극과 음극 전극, aligner과 샘플 컵 표시줄과 샘플 컵을 포함합니다.
EPS 3501 XL 전원 공급 장치	GE 헬스케어	18-1130-05	용품 3,500 최대 전압 V.
Multiphor II 전기 영동 단위	GE 헬스케어	18-1018-06	가동 전극은 모든 길이의 IPG 스트립에서 IEF를 활성화 (7-24센티미터가 스트립을 IPG)
PerfectBlue 젤 시스템 트윈 S	Peqlab	45-1010 - C	10x10 cm 미니 젤 형식의 SDS - PAGE. 젤 챔버는 냉각 시스템이 포함되어 있습니다.
: 콜로이드 쿠매시 G - 250 염색법에 대한
뚜껑과 함께 요리를 염색법	VWR	216-3412	미니 젤에 대한 힘드 네요. 쉐이크에 Stackable.
알루미늄 황산 - 18 - 하이드 레이트	머크	1.01102.5000	우리는 머크와 함께 최고의 경험을했다. 5kg 패키지에 단지 가능합니다.
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