Veloce e sensibile colloidale Coomassie G-250 colorazione per le proteine ​​in gel di poliacrilammide

Riepilogo

Questo video è diffondere una colloidale Coomassie G-250 protocollo di colorazione a seconda Kang Et al. Per la rilevazione di media 4 ng proteine ​​in gel. La colorazione è completata entro 2 ore e senza alcuno sforzo. Noi abitualmente utilizzano il protocollo di Kang per scopi di analisi in gel a base di proteomica.

Abstract

Coomassie Brilliant Blue (CBB) è un colorante comunemente utilizzato per la visualizzazione di proteine ​​separate mediante SDS-PAGE, offrendo una procedura semplice colorazione e quantificazione alto. Inoltre, è completamente compatibile con l'identificazione delle proteine ​​spettrometria di massa. Ma nonostante questi vantaggi, CBB è considerato essere meno sensibile di colorazioni argento o fluorescenza e quindi raramente utilizzato per la rilevazione di proteine ​​in gel analitici approcci basati sulla proteomica.

Diversi miglioramenti del protocollo originale Coomassie ¹ sono stati fatti per aumentare la sensibilità della CBB. Due importanti modifiche sono state introdotte per migliorare la rilevazione di proteine ​​a bassa abbondanza convertendo le molecole di colorante in particelle colloidali: Nel 1988, Neuhoff e colleghi hanno applicato il 20% metanolo e concentrazioni più elevate di solfato di ammonio nel G-250 CBB soluzione colorante a base ^2, e nel 2004 Candiano et al. stabilito Blue Silver con CBB G-250 con acido fosforico in presenza di solfato di ammonio e metanolo ^3. Tuttavia, tutte queste modifiche solo permettono una rilevazione di circa 10 proteine ​​ng. Un protocollo ampiamente fameless per la colorazione Coomassie colloidale è stato pubblicato da Kang et al. Nel 2002 dove si è modificato Neuhoff colloidale protocollo di colorazione CBB per quanto riguarda le sostanze complessanti. Invece di solfato di ammonio hanno usato solfato di alluminio e il metanolo è stato sostituito dal ⁴ etanolo meno tossici. Il romanzo a base di alluminio colorazione in studio Kang ha dimostrato una sensibilità superiore che rileva fino a 1 ng / banda (fosforilasi b) con variazione scarsa sensibilità in funzione delle proteine.

In questo studio dimostriamo applicazione del protocollo di Kang per una rapida e sensibile colorazione Coomassie colloidale di proteine ​​per scopi di analisi. Ci illustrerà il protocollo veloce e semplice utilizzando bidimensionali gel eseguita di routine nel nostro gruppo di lavoro.

Protocollo

Parte 1: bidimensionale (2-D), elettroforesi su gel con coppa di carico

1. IPG-strip reidratazione e concentrandosi isoelettrico (IEF)
   • Reidratare gel DryStrip Immobiline, pH 6-11 (7 cm) in 125 microlitri soluzione di reidratazione [7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 50 hydroxyethyldisulfide mM e 2% IPG tampone pH 6-11] usa il cassetto Immobiline DryStrip Reswelling per almeno 10 ore.
   • Sciogliere campione precipitato proteine ​​in un tampone campione IEF [7 M urea, 2 M tiourea, 2% CHAPS, 2% ASB-14, 50 hydroxyethyldisulfide mM e 2% IPG tampone pH 6-11] corrispondente a 60-100 mg di proteine ​​per 100 l .
   • Dopo solubilizzazione (almeno 30 minuti a temperatura ambiente), si applicano campione di proteine ​​tramite anodica coppa carico con coppe campioni. Il volume della tazza è 100 l (tazze Collettore permette fino a 150 microlitri).
     Nota: è possibile caricare quantità di campione più grande se si inserisce una bassa tensione passo all'inizio del protocollo di messa a fuoco e riempire le tazze mentre c'è ancora un film liquido nella tazza!
   • Eseguire isoelettrofocusing per 11,1 KVH in modalità gradiente nell'Unità Multiphor elettroforesi II.
2. Equilibrazione e SDS-PAGE
   • Dopo IEF, le strisce IPG sono stati sottoposti a riduzione e alchilazione, ogni volta 15 minuti su uno shaker, con l'1% e al 2,5% ditiotreitolo Iodoacetamide rispettivamente in soluzione di equilibrio [50 mM Tris-HCl/pH 8.8, 6 M urea, 30% glicerolo e il 2% SDS].
   • Lavare le strisce equilibrata con H ₂ O e asciugare su carta Whatman loro di rimuovere il tampone in eccesso equilibrio. Successivamente immergere le strisce in SDS-running buffer (1X).
   • Seconda dimensione è effettuata mediante SDS-PAGE su sistemi di elettroforesi verticale con una concentrazione di acrilamide totale di 12%. Le strisce IPG equilibrati sono stati collocati sulla parte superiore del gel di separazione e fissato con una soluzione calda agarosio [0,5% di agarosio nella gestione di tampone contenente bromofenolo blu].
   • Le proteine ​​sono state separate per 2,5 ore, a partire da 80 V per 15 minuti seguito da 120 V fino a quando il fronte del colorante raggiunge il fondo della cassetta gel.

Parte 2: colorazione Coomassie Colloidale con CBB G-250

1. Soluzioni coloranti
Nota: per la preparazione delle soluzioni colorazione, usare prodotti chimici di alta qualità come puri per analisi (pa) e di acqua di elevata purezza, come si ottiene da sistemi Millipore (Milli-Q acqua).

Coomassie soluzione:		AD 2000 ml H 2 O
0,02% (w / v)	CBB G-250	0,4 g
5% (w / v)	solfato di alluminio (14-18)-idrato	100 g
10% (v / v)	etanolo (96%)	200 ml
2% (v / v)	Acido ortofosforico (85%)	47 ml

Nota: per la preparazione della soluzione colorante, l'aggiunta sequenziale dei componenti nel seguente ordine deve essere mantenuta:

1. prima sciogliere solfato di alluminio in acqua Milli-Q
2. successivamente aggiungere etanolo, omogeneizzare e miscelare CBB G-250 alla soluzione
3. di recente, la soluzione è completamente sciolto, aggiungere l'acido fosforico (l'incorporazione dell'acido ai media alcolica lascia le molecole si aggregano in Coomassie loro stato colloidale)
4. infine si riempiono di acqua Milli-Q

Nota: la soluzione finale ha una colorazione verde scuro-bluastro aspetto ed è piena di particelle di nuoto in giro:

• Non filtrato questa soluzione!
• Se hai cambiato l'ordine di preparazione, si otterrebbe una soluzione più violetto-bluastro che è meno sensibile.

Decolorazione soluzione:		AD 2000 ml H 2 O
10% (v / v)	etanolo (96%)	200 ml
2% (v / v)	Acido ortofosforico (85%)	47 ml

2. Procedura di colorazione

• Dopo la separazione seconda dimensione, rimuovere con attenzione i gel dalle lastre di vetro e trasferirli in un piatto colorazione piena di acqua Milli-Q.
• Lavare il gel tre volte con acqua Milli-Q per 10 minuti su un agitatore orizzontale (lavaggio insufficiente provoca scarsa sensibilità perché il restante SDS sul gel disturba la delimitazione del colorante alle proteine).
• Agitare la soluzione di Coomassie prima dell'uso per disperdere le particelle colloidali in modo uniforme.
• Incubare il gel ben coperto con la soluzione di Coomassie di agitazione su un agitatore per 2-12 ore. Questo genera colorazione di fondo marginali in modo da poter osservare i progressi colorazione in mezzo.
  Nota: dopo 10 minuti si possono vedere macchie di proteine ​​prima apparizione, entro 2 ore di incubazione di circa l'80% colorazione ad essolivello massimo s è stato completato. Per quasi 100 colorazione%, notte di incubazione è raccomandato. In alcuni casi, quando la quantità di proteine ​​ad essere macchiato è enorme e la soluzione si trasforma in un azzurro brillante, un aggiornamento della soluzione di colorazione è necessario.
• Dopo la procedura di colorazione Coomassie rimuovere la soluzione e sciacquare il gel due volte con acqua Milli-Q.
  Nota: è possibile riutilizzare la soluzione colorante fino a quando le particelle sono ancora presenti, altrimenti scartare (tenere a mente che il vostro laboratorio può avere norme speciali per lo smaltimento dei rifiuti).
• Rimuovere attaccare le particelle del colorante dal piatto colorazione con un panno privo di tovagliolo di carta e Decolorare per 10 - 60 minuti.
  Nota: è anche possibile lavare il gel solo con acqua Milli-Q, ma questo si consiglia solo per preparativa gel perché durerà un irregolare, debole film di Coomassie il gel che si presentano durante la procedura di scansione.
• Infine risciacquare il gel due volte con acqua Milli-Q: il gel raggiungeranno il loro spessore originale (l'alcool-acido multimediali rende la contrazione gel) e neutralizzazione in acqua aumenta ulteriormente l'intensità del colore di Coomassie.

Parte 3: I risultati rappresentativi

Se si segue il protocollo sopra descritto si ottengono sul 2-D gel distintivi risolto e ben colorati macchie scure proteina blu. Anche rispetto ad un 2-D gel colorato con l'argento secondo Shevchenko et al. ^5, un protocollo sostenendo buona sensibilità e la compatibilità con la spettrometria di massa, otteniamo risultati della colorazione uguale.

Figura 1: risultato finale della sperimentazione di cui sopra. Kang Coomassie protocollo (A) esegue con forza come la colorazione argento secondo Shevchenko et al. (B) a individuare le proteine ​​dopo 2-D elettroforesi su gel.

Parte 4: Suggerimenti

• Eseguire alcune colorazioni di prova prima di elaborare i propri campioni. Per motivi inspiegabili abbiamo riportato qualche volta che una proteina di interesse non è stato possibile rilevare con successo anche quando milligrammi sono state applicate. In questo caso si consiglia di preparare alcune serie di diluizioni per testare la sensibilità.
• Se avete a basso contenuto di gel di rilevazione della proteina (s) in generale, il trasferimento senza successo dal accatastamento al gel di separazione durante la SDS-PAGE sarà eventualmente il motivo. È possibile verificare tali proteine ​​adesive dalla colorazione il gel compresa l'area di sovrapposizione.
• Per una rapida verifica dei risultati isoelettrofocusing, è possibile direttamente macchiare la IPG-strip senza alcun ulteriore separazione seconda dimensione.
• Di tanto in tanto girare il gel durante la procedura di colorazione in modo che siano macchiati uniformemente da entrambi i lati (se si mantiene il gel immobile, il colorante si lega solo per una parte del gel).
• Abbiamo sperimentato che lo stoccaggio della soluzione colorante in una bottiglia scura aumenta la sua durata (in bottiglia trasparente fino a 4 mesi).
• Dopo la colorazione e la documentazione è possibile mantenere il gel in frigorifero per diversi anni (se si aggiunge soluzione acida di evitare contaminazioni da funghi).
• Decolorazione di spine gel per un trittico digerire può essere accelerata dal riscaldamento in un riscaldatore blocco.

Discussione

Innovativi o solo un altro protocollo Coomassie?

Al momento esistono diversi protocolli per le procedure di colorazione con Coomassie Brilliant Blue. La maggior parte di loro il risultato di modifiche minori o maggiori di uno dei protocolli più comunemente utilizzati dai Neuhoff e colleghi ^2. Anche il protocollo di Kang basato sulla formula di Neuhoff. Ma è davvero un'alternativa metodo di colorazione Coomassie per la ricerca proteomica? Noi immagine due questioni principali...

Materiali

Nome del prodotto	Azienda	Catalogo No.	Commenti
Per IEF e SDS-PAGE:
Immobiline DryStrip gel	GE Healthcare	17-6001-94	Può essere utilizzato anche 2 anni dopo la data di scadenza.
Immobiline DryStrip Reswelling Vassoio	GE Healthcare	80-6371-84	Non pulire con solventi organici. Progettato per 7-18 centimetri IPG-strisce.
Immobiline DryStrip Kit	GE Healthcare	18-1004-30	Include un vassoio di elettrodi, portaelettrodi, anodo e catodo, allineatore e coppa campioni bar e coppe campioni.
EPS 3501 XL Alimentazione	GE Healthcare	18-1130-05	Forniture di tensione fino a 3500 V.
Multiphor II elettroforesi Unità	GE Healthcare	18-1018-06	Elettrodi mobili consentono IEF in strisce IPG di ogni lunghezza (7-24 centimetri IPG strisce)
PerfectBlue gel sistema Doppia S	Peqlab	45-1010-C	SDS-PAGE in 10x10 cm mini-gel formato. Gel da camera comprende un sistema di raffreddamento.
Per colloidale Coomassie G-250 colorazione:
colorazione piatti con coperchi	VWR	216-3412	Adatto per mini-gel. Sovrapposte a shaker.
solfato di alluminio-18-idrato	Merck	1.01102.5000	Abbiamo fatto migliore esperienza con Merck. Appena disponibile in 5 pacchetti kg.
ortofosforico	Prolabo	20 624.295	Venduto in bottiglie di vetro.