A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
וידאו זה יהיה פופולרי colloidal Coomassie G-250 פרוטוקול מכתים פי קאנג Et al. לצורך זיהוי של חלבון 4 ממוצע ng ב ג'לים. מכתים הושלם בתוך 2 שעות ללא כל מאמץ. אנו משתמשים באופן שגרתי פרוטוקול של קאנג למטרות אנליטיות הג'ל מבוסס proteomics.
Coomassie מבריק כחול (CBB) הוא צבע נפוץ עבור להדמיה של חלבונים מופרדים על ידי SDS-PAGE, המציע הליך מכתים פשוט quantitation גבוהה. יתר על כן, הוא תואם לחלוטין עם הזדהות המונית חלבון spectrometric. אך למרות יתרונות אלה, CBB נחשב להיות רגישים פחות כסף או stainings הקרינה ולכן רק לעתים נדירות נעשה שימוש לצורך זיהוי של חלבונים הג'ל מבוסס גישות אנליטיות proteomic.
שיפורים אחדים המקורי Coomassie פרוטוקול 1 נעשו כדי להגדיל את הרגישות של CBB. שני השינויים העיקריים שהוכנסו על מנת לשפר את הזיהוי של נמוכה שפע חלבונים ידי המרת מולקולות צבען לחלקיקים colloidal: בשנת 1988 חל נייהוף ועמיתיו מתנול 20% ו ריכוזים גבוהים יותר של אמוניום סולפט לתוך פתרון ה-G-250 מכתים CBB מבוסס 2, ובשנת 2004 Candiano et al. הוקמה כסף כחול באמצעות CBB G-250 עם חומצה זרחתית בנוכחות סולפאט אמוניום, מתנול 3. עם זאת, כל השינויים האלה רק לאפשר זיהוי של חלבון כ 10 ננוגרם. פרוטוקול fameless נרחב מכתים Coomassie colloidal פורסם על ידי קאנג et al. בשנת 2002 שונה שם הם מכתים פרוטוקול colloidal של נייהוף CBB לגבי חומרים complexing. במקום אמוניום סולפט הם השתמשו סולפט אלומיניום מתנול הוחלף 4 אתנול פחות רעיל. אלומיניום מבוסס הרומן מכתים במחקר של קאנג הראו רגישות מעולה שמזהה נמוך כמו 1 ng / להקה (phosphorylase ב) עם וריאציה קצת רגישות בהתאם חלבונים.
הנה, אנחנו מדגימים יישום פרוטוקול של קאנג עבור מכתים מהיר ורגיש Coomassie colloidal של חלבונים למטרות אנליטיות. נדגים את פרוטוקול מהירה וקלה באמצעות דו מימדי ג'לים ביצע באופן שגרתי בקבוצת העבודה שלנו.
חלק 1: דו מימדי (2-D) ג'ל אלקטרופורזה באמצעות כוס העמסה
חלק 2: Colloidal מכתים Coomassie עם CBB G-250
1. מכתים פתרונות
הערה: להכנת הפתרונות מכתים, להשתמש בחומרים כימיים עם איכות גבוהה כגון כיתה אנליטית (רש"פ) ומים של טוהר גבוה ככל שאתה מקבל Millipore מערכות (מילי-Q מים).
Coomassie פתרון: | מודעה 2000 מ"ל H 2 O | |
0.02% (w / v) | CBB G-250 | 0,4 גרם |
5% (w / v) | אלומיניום סולפט (14-18), מימה | 100 גרם |
10% (V / V) | אתנול (96%) | 200 מ"ל |
2% (V / V) | orthophosphoric חומצה (85%) | 47 מ"ל |
הערה: להכנת הפתרון מכתים, הוספת רציפים המרכיבים לפי הסדר הבא חייב להישמר:
הערה: הפתרון הסופי מכתים יש מראה כהה ירוק כחלחל מלא חלקיקים שחייה סביב:
Destaining פתרון: | מודעה 2000 מ"ל H 2 O | |
10% (V / V) | אתנול (96%) | 200 מ"ל |
2% (V / V) | orthophosphoric חומצה (85%) | 47 מ"ל |
2. מכתים נוהל
חלק 3: תוצאות נציג
אם אתה מבין את הפרוטוקול המתואר לעיל תקבל על 2-D שלך הייחודי ג'ל נקודות נפתרה גם מוכתם כחול כהה חלבון. אפילו בהשוואה ג'ל 2-D מוכתם כסף לפי שבצ'נקו et al. 5, פרוטוקול בטענה רגישות תאימות טובה עם ספקטרומטריית מסה, אנחנו משיגים תוצאות מכתים שווים.
איור 1: התוצאה הסופית של הניסויים שתוארו לעיל. Coomassie קאנג של פרוטוקול (א) מבצע חזק כמו מכתים את הכסף על פי שבצ'נקו et al. (ב) באיתור חלבונים לאחר אלקטרופורזה 2 D-ג'ל.
חלק 4: טיפים וטריקים
חדשני או רק עוד פרוטוקול Coomassie?
כרגע קיימים פרוטוקולים מרובים עבור מכתים נהלים Coomassie כחול מבריק. רובם תוצאה של שינויים קלים או גדולים של אחד הפרוטוקולים הנפוצים ביותר על ידי נייהוף ועמיתיו 2. כמו כן, פרוטוקול של קאנג מבוסס על ...
אנו מודים לד"ר ניקולה Wiethölter עבור הכנת מכתים של 1-D ג'לים.
עבודה זו מומנה על ידי מענק מטעם דויטשה Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 ל ND ו - SM) ונתמך על ידי מענק מחקר מן Manchot יורגן Stiftung ל ND.
שם המוצר | חברה | מספר קטלוגי | תגובות |
עבור IEF ו SDS-PAGE: | |||
Immobiline DryStrip ג'לים | GE Healthcare | 17-6001-94 | יכול גם לשמש 2 שנים לאחר פקיעת תאריך. |
Immobiline DryStrip מגש Reswelling | GE Healthcare | 80-6371-84 | אין לנקות עם ממסים אורגניים. עוצב עבור 7-18 ס"מ IPG, רצועות. |
Immobiline DryStrip Kit | GE Healthcare | 18-1004-30 | כולל מגש, מחזיק אלקטרודות, אנודה קתודה אלקטרודות, aligner וכוס בר מדגם כוסות המדגם. |
EPS 3501 XL ספק כוח | GE Healthcare | 18-1130-05 | ספקי מתח עד 3500 V. |
Multiphor II יחידת אלקטרופורזה | GE Healthcare | 18-1018-06 | אלקטרודות Movable לאפשר IEF ברצועות IPG אורך הכול (7-24 ס"מ IPG רצועות) |
PerfectBlue ג'ל מערכת Twin S | Peqlab | 45-1010-C | SDS-PAGE בפורמט 10x10 ס"מ מיני ג'ל. ג'ל קאמרית כולל מערכת קירור. |
עבור colloidal מכתים Coomassie G-250: | |||
מכתים מנות עם מכסים | VWR | 216-3412 | מתאים עבור מיני ג'לים. Stackable על שייקר. |
אלומיניום סולפט-18-מימה | מרק | 1.01102.5000 | עשינו את החוויה הטובה ביותר עם מרק. זמין רק בחבילה 5 ק"ג. |
orthophosphoric חומצה | Prolabo | 20 624.295 | נמכר בתוך בקבוקי זכוכית. |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved