Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Это видео должно популяризировать коллоидных Кумасси G-250 окрашивания протокол в соответствии с Кан Соавт. Для обнаружения среднем 4 нг белка в гелях. Окрашивание выполняется в течение 2 часов и без каких-либо усилий. Мы регулярно использовать протокол Канга для аналитических целей в основе геля протеомики.
Кумасси бриллиантовый синий (CBB) является красителя обычно используется для визуализации белков, разделенных SDS-PAGE, предлагая простой процедуры окрашивания и высокий количественный. Кроме того, она полностью совместима с масс-спектрометрического идентификации белков. Но, несмотря на эти преимущества, CBB считается, менее чувствительны, чем серебро или флуоресценции окрашивания и поэтому редко используется для обнаружения белка в аналитической гель подходов протеомных.
Несколько улучшений оригинальной Кумасси протокол 1 были внесены повысить чувствительность CBB. Два основных изменения были внесены для повышения вероятности обнаружения низкого обильные белки путем преобразования молекул красителя в коллоидных частиц: В 1988 году Neuhoff и коллеги применяется 20% метанола и более высокие концентрации сульфата аммония в CBB G-250 решение на базе окрашивания 2, а в 2004 году Candiano и соавт. создана Blue Silver использованием CBB G-250 с фосфорной кислотой в присутствии сульфата аммония и метанола 3. Тем не менее, все эти изменения просто позволить обнаружения приблизительно 10 нг белка. Широко неизвестный протокол для коллоидного окрашивания Кумасси был опубликован Кан и соавт. В 2002 году, где они изменение коллоидного окрашивания CBB Neuhoff в протокол о комплексообразующих веществ. Вместо того, сульфат аммония они использовали сульфат алюминия и метанола была заменена менее токсичны этанола 4. Роман на основе алюминия, окрашивание в исследовании Кан показал высокую чувствительность, которая обнаруживает, даже в 1 нг / полоса (фосфорилазы б) с небольшим изменением чувствительности в зависимости от белков.
Здесь мы демонстрируем применение протокола Канга для быстрого и чувствительного коллоидного окрашивания Кумасси белков в аналитических целях. Мы проиллюстрируем быстрый и легкий протокол, используя двумерный гель регулярно проводится в нашей рабочей группы.
Часть 1: двумерные (2-D) гель-электрофореза использованием чашки загрузкой
Часть 2: Коллоидное окрашивание Кумасси с CBB G-250
1. Окрашивание решения
Примечание: для подготовки окрашивания решений, использование химических веществ с высоким качеством, таких как аналитические класса (в год) и водой высокого качества, как вы получите от Millipore систем (Milli-Q воды).
Кумасси решение: | объявление 2000 мл H 2 O | |
0,02% (м / о) | CBB G-250 | 0,4 г |
5% (м / о) | сульфата алюминия-(14-18)-гидрат | 100 г |
10% (объем / объем) | этанол (96%) | 200 мл |
2% (об. / об) | ортофосфорной кислоты (85%) | 47 мл |
Примечание: для подготовки красящим раствором, последовательного добавления компонентов в следующем порядке должна быть сохранена:
Примечание: окончательное решение окрашивания имеет темно-зеленые, голубоватые внешний вид и полное частиц плавание вокруг:
Destaining решение: | объявление 2000 мл H 2 O | |
10% (объем / объем) | этанол (96%) | 200 мл |
2% (об. / об) | ортофосфорной кислоты (85%) | 47 мл |
2. Процедура окраски
Часть 3: Представитель результаты
Если вы будете следовать протоколу, описанных выше, вы получите на свой 2-D геле отличительные решен и хорошо окрашенные темно синие пятна белка. Даже по сравнению с 2-D гель окрашивали серебром в соответствии с Шевченко и соавт. 5, протокол утверждая, хорошую чувствительность и совместимость с масс-спектрометрии, мы достигаем равные результаты окрашивания.
Рисунок 1: Окончательный результат экспериментов, описанных выше. Канга Кумасси протокол () выполняет сильно, как окрашивания серебром в соответствии с Шевченко и соавт. (B) для выявления белков после 2-D электрофореза геля.
Часть 4: Советы и рекомендации
Инновационные или просто еще один протокол Кумасси?
На данный момент существует множество протоколов для окрашивания процедуры Кумасси бриллиантовый синий. Большинство из них возникают незначительные или значительные изменения одного из наиболее широко используемы?...
Мы благодарим доктора Никола Wiethölter для подготовки и окрашивания 1-D гелей.
Эта работа финансировалась за счет гранта Deutsche Forschungsgemeinschaft (ГРК 1089/project 5 до Н. Д. и С. М.) и при поддержке исследований общении с Юргеном Manchot Stiftung в НД.
Наименование продукта | Компания | Каталог Нет. | Комментарии |
Для МЭФ и SDS-PAGE: | |||
Immobiline DryStrip гели | GE Healthcare | 17-6001-94 | Может использоваться даже спустя 2 года после срока годности. |
Immobiline DryStrip Reswelling лоток | GE Healthcare | 80-6371-84 | Не чистите с органическими растворителями. Предназначен для 7-18 см IPG-полосок. |
Immobiline DryStrip Kit | GE Healthcare | 18-1004-30 | Включает в себя поднос, держатель электрода, анода и катода электродов, выравниватель и бар образец чашки и стаканы образца. |
EPS 3501 XL питания | GE Healthcare | 18-1130-05 | Поставки напряжением до 3500 В. |
Multiphor II группы Электрофорез | GE Healthcare | 18-1018-06 | Подвижные электроды позволяют МЭФ в IPG полос всей длине (7-24 см IPG полос) |
PerfectBlue гелевой системы Твин S | Peqlab | 45-1010-C | SDS-PAGE в 10х10 см мини-гель формате. Гель камера включает в себя системы охлаждения. |
Для коллоидных Кумасси G-250 окрашивания: | |||
окрашивание блюда с крышками | VWR | 216-3412 | Подходит для мини-гелей. Стекируемые на шейкере. |
сульфата алюминия-18-гидрат | Merck | 1.01102.5000 | Мы сделали лучший опыт Merck. Просто доступен в 5-килограммовой упаковки. |
ортофосфорная кислота | Prolabo | 20 624.295 | Продается в стеклянных бутылках. |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены