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Method Article
Cette vidéo est de populariser une colloïdale Coomassie G-250 protocole de coloration en fonction de Kang Et al. Pour la détection de protéines moyenne 4 ng dans les gels. La coloration est terminé dans les 2 heures et sans aucun effort. Nous utilisons régulièrement le protocole de Kang des fins d'analyse en gel à base de protéomique.
Coomassie Brilliant Blue (CBB) est un colorant couramment utilisé pour la visualisation des protéines séparées par SDS-PAGE, offrant une procédure de coloration simple et quantification élevée. Par ailleurs, il est totalement compatible avec l'identification des protéines par spectrométrie de masse. Mais malgré ces avantages, CBB est considéré comme moins sensible que d'argent ou de colorations fluorescence et donc rarement utilisés pour la détection des protéines dans les approches protéomiques analytiques à base de gel.
Plusieurs améliorations de l'original du protocole 1 de Coomassie ont été faits pour augmenter la sensibilité de la CBB. Deux modifications majeures ont été introduites pour améliorer la détection de protéines de faible abondance par la conversion des molécules de colorant dans les particules colloïdales: En 1988, Neuhoff et ses collègues ont utilisé 20% de méthanol et de plus fortes concentrations de sulfate d'ammonium dans le CBB G-250 une solution de coloration basée 2, et en 2004, al Candiano et al. établie Blue Silver utilisant CBB G-250 avec de l'acide phosphorique en présence de sulfate d'ammonium et de méthanol 3. Néanmoins, toutes ces modifications permettent simplement une détection d'environ 10 ng de protéines. Un protocole largement fameless pour Coomassie coloration colloïdale a été publié par Kang et al. En 2002 où ils ont modifié le protocole Neuhoff colloïdale coloration CBB concernant les substances complexantes. Au lieu de sulfate d'ammonium ils ont utilisé du sulfate d'aluminium et de méthanol a été remplacé par le 4 éthanol moins toxiques. La base d'aluminium dans l'étude de nouvelles taches de Kang a montré une sensibilité supérieure, qui détecte aussi bas que 1 ng / bande (phosphorylase b) avec une variation peu de sensibilité en fonction des protéines.
Ici, nous démontrons l'application du protocole de Kang rapide et sensible pour la coloration de Coomassie colloïdal de protéines à des fins analytiques. Nous allons illustrer le protocole rapide et facile en utilisant des gels bidimensionnels en routine dans notre groupe de travail.
Partie 1: l'électrophorèse bidimensionnelle sur gel (2-D) à l'aide de la Coupe de chargement
Partie 2: coloration de Coomassie colloïdal avec CBB G-250
1. Solutions de coloration
Remarque: pour la préparation des solutions de coloration, utiliser des produits chimiques de haute qualité tels que la qualité analytique (PA) et d'eau de grande pureté que vous obtenez à partir de systèmes Millipore (eau Milli-Q).
Solution de Coomassie: | ad 2000 ml H 2 O | |
0,02% (p / v) | CBB G-250 | 0,4 g |
5% (p / v) | sulfate d'aluminium (14-18)-hydrate | 100 g |
10% (v / v) | l'éthanol (96%) | 200 ml |
2% (v / v) | l'acide orthophosphorique (85%) | 47 ml |
Remarque: pour la préparation de la solution de coloration, l'addition séquentielle des composants dans l'ordre suivant doit être maintenu:
Remarque: la solution de coloration finale a une couleur vert foncé-bleu apparence et est plein de particules nageant autour:
Décoloration solution: | ad 2000 ml H 2 O | |
10% (v / v) | l'éthanol (96%) | 200 ml |
2% (v / v) | l'acide orthophosphorique (85%) | 47 ml |
2. Procédure de coloration
Partie 3: Les résultats représentatifs
Si vous suivez le protocole décrit ci-dessus, vous obtiendrez sur votre 2-D de gel distinctifs résolus et bien teinté foncé spots protéiques bleu. Même par rapport à un gel 2-D taché avec de l'argent en fonction de Shevchenko et al. 5, un protocole affirmant une bonne sensibilité et une compatibilité avec la spectrométrie de masse, nous obtenons des résultats coloration égale.
Figure 1: Résultat final de l'expérimentation décrite ci-dessus. Kang Coomassie protocole (A) effectue vivement, comme la coloration d'argent conformément à Shevchenko et al. (B) dans la détection des protéines après 2-D électrophorèse sur gel.
Partie 4: Trucs et astuces
Innovants ou tout simplement un autre protocole de Coomassie?
À l'heure actuelle, il existe plusieurs protocoles pour les procédures de coloration de Coomassie Brilliant Blue. La plupart d'entre eux résultent de modifications mineures ou majeures de l'un des protocoles les plus couramment utilisés par les Neuhoff et ses collègues 2. Aussi le protocole Kang est basé sur la formule de Neuhoff. Mais est-ce vraiment une méthode de coloration au bleu de Coomassie alt...
Nous remercions le Dr Nicola Wiethölter de la préparation et la coloration de 1 D-gels.
Ce travail a été financé par une subvention de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 à ND et SM) et soutenu par une bourse de recherche de l'Manchot Jürgen Stiftung à ND.
Nom du produit | Société | No de catalogue | Commentaires |
Pour l'IEF et SDS-PAGE: | |||
Immobiline DryStrip gels | GE Healthcare | 17-6001-94 | Peut même être utilisé 2 ans après la date d'expiration. |
Immobiline DryStrip Reswelling Plateau | GE Healthcare | 80-6371-84 | Ne pas nettoyer avec des solvants organiques. Conçu pour les 7-18 cm IPG-bandes. |
Immobiline DryStrip Kit | GE Healthcare | 18-1004-30 | Comprend un plateau électrodes, porte-électrodes, anode et cathode, aligneur et le bar de la Coupe de l'échantillon et des coupes de l'échantillon. |
EPS 3501 Alimentation XL | GE Healthcare | 18-1130-05 | Fournitures de tension jusqu'à 3500 V. |
Unité Multiphor électrophorèse II | GE Healthcare | 18-1018-06 | Électrodes mobiles permettent l'IEF dans les bandes IPG de toute longueur (7-24 cm IPG strips) |
PerfectBlue gel de système Twin S | Peqlab | 45-1010-C | SDS-PAGE en 10x10 cm mini-gel format. Gel chambre comprend un système de refroidissement. |
Pour colloïdale Coomassie G-250 de coloration: | |||
coloration des plats avec des couvercles | VWR | 216-3412 | Convient pour les mini-gels. Empilable sur agitateur. |
sulfate d'aluminium-18-hydrate | Merck | 1.01102.5000 | Nous avons fait une meilleure expérience avec Merck. Juste disponible en 5 kg emballage. |
l'acide orthophosphorique | Prolabo | 20 624.295 | Vendu en bouteilles de verre. |
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