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Method Article
Este vídeo é popularizar uma coloidal Coomassie G-250 protocolo de coloração de acordo com Kang Et al. Para a detecção de proteínas ng média de 4 em géis. A coloração é concluída dentro de duas horas e sem qualquer esforço. Rotineiramente utilizam o protocolo Kang para fins analíticos, de gel com base em proteômica.
Coomassie Brilliant Blue (CBB) é um corante comumente usado para a visualização de proteínas separadas por SDS-PAGE, oferecendo um processo de coloração simples e quantificação de altura. Além disso, é totalmente compatível com identificação de proteínas espectrometria de massa. Mas, apesar dessas vantagens, a CBB é considerado para ser menos sensível do que a prata ou colorações de fluorescência e, portanto, raramente usado para a detecção de proteínas em gel analítica abordagens baseadas em proteômica.
Várias melhorias do original Coomassie protocolo 1 foram feitas para aumentar a sensibilidade da CBB. Duas grandes modificações foram introduzidas para aumentar a detecção de proteínas de baixa abundância, convertendo as moléculas de corante em partículas coloidais: Em 1988, Neuhoff e colegas aplicaram 20% de metanol e maiores concentrações de sulfato de amônio no G-250 CBB solução corante com base 2, e em 2004 Candiano et al. estabelecida Prata Azul usando CBB G-250 com ácido fosfórico na presença de sulfato de amônio e metanol 3. No entanto, todas estas modificações apenas permitem uma detecção de aproximadamente 10 ng de proteína. Um protocolo muito obscuro para a coloração Coomassie coloidal foi publicado por Kang et al. Em 2002, onde eles modificaram Neuhoff protocolo de coloração coloidal CBB sobre as substâncias complexantes. Em vez de sulfato de amônio que usaram sulfato de alumínio e metanol foi substituído pelo 4 etanol menos tóxicos. A base de alumínio romance coloração em estudo Kang mostrou sensibilidade superior que detecta tão baixos como 1 ng / banda (fosforilase b) com variação pouca sensibilidade dependendo proteínas.
Aqui, nós demonstrar a aplicação do protocolo de Kang para rápido e sensível coloração Coomassie coloidal de proteínas em fins analíticos. Vamos ilustrar o protocolo rápido e fácil usando géis bi-dimensional realizada rotineiramente em nosso grupo de trabalho.
Parte 1: Two-dimensional eletroforese em gel (2-D), utilizando taça de carregamento
Parte 2: coloração Coomassie coloidal com CBB G-250
1. Soluções de coloração
Nota: para a preparação das soluções de coloração, utilize produtos químicos com alta qualidade, tais como grau analítico (pa) e água de alta pureza como você começa a partir Millipore sistemas (água Milli-Q).
Solução de Coomassie: | ad 2000 ml H 2 O | |
0,02% (w / v) | CBB G-250 | 0,4 g |
5% (w / v) | sulfato de alumínio (14-18)-hidrato | 100 g |
10% (v / v) | etanol (96%) | 200 ml |
2% (v / v) | ácido ortofosfórico (85%) | 47 ml |
Nota: para a preparação da solução de coloração, a adição seqüencial dos componentes na seguinte ordem tem de ser mantido:
Nota: a solução de coloração final tem uma aparência verde-azulado escuro e está cheio de partículas de natação ao redor:
Descoloração solução: | ad 2000 ml H 2 O | |
10% (v / v) | etanol (96%) | 200 ml |
2% (v / v) | ácido ortofosfórico (85%) | 47 ml |
2. Processo de coloração
Parte 3: Os resultados representativos
Se você seguir o protocolo descrito acima, você receberá em seu gel 2-D distintas e bem resolvida manchado manchas escuras proteína azul. Mesmo comparado a um gel 2-D corados com prata de acordo com Shevchenko et al. 5, um protocolo alegando boa sensibilidade e compatibilidade com espectrometria de massa, conseguimos resultados de coloração igual.
Figura 1: Resultado das experiências descritas acima. Coomassie Kang protocolo (A) realiza fortemente como a coloração pela prata de acordo com Shevchenko et al. (B) na detecção de proteínas após o 2-D eletroforese em gel.
Parte 4: Dicas e truques
Inovadora ou apenas outro protocolo Coomassie?
No momento existem vários protocolos para a coloração de procedimentos com Coomassie Brilliant Blue. A maioria deles o resultado de modificações maiores ou menores de um dos protocolos mais comumente usados por Neuhoff e colegas 2. Também protocolo Kang é baseado na fórmula de Neuhoff. Mas é realmente um método de coloração Coomassie alternativa para a pesquisa proteômica? Vamos imagem duas questões principais, lim...
Agradecemos ao Dr. Nicola Wiethölter para a preparação e coloração de 1-D gels.
Este trabalho foi financiado por uma doação da Deutsche Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 a ND e SM) e apoiado por uma bolsa de pesquisa do Manchot Jürgen Stiftung para ND.
Nome do produto | Companhia | No. de catálogo | Comentários |
Para IEF e SDS-PAGE: | |||
Immobiline DryStrip géis | GE Healthcare | 17-6001-94 | Pode até ser usado dois anos após a data expirar. |
Immobiline DryStrip Bandeja Reswelling | GE Healthcare | 80-6371-84 | Não devem ser limpos com solventes orgânicos. Projetado para 7-18 centímetros IPG-tiras. |
Immobiline DryStrip Kit | GE Healthcare | 18-1004-30 | Inclui uma bandeja, porta-eletrodo anodo e catodo de eletrodos, alinhador e bar copo de amostra e copos de amostra. |
EPS 3501 Alimentação XL | GE Healthcare | 18-1130-05 | Fontes de tensão até 3500 V. |
Multiphor Unidade II Eletroforese | GE Healthcare | 18-1018-06 | Eletrodos móveis permitem IEF em tiras IPG de todo o comprimento (7-24 centímetros IPG strips) |
Perfectblue gel sistema Twin S | Peqlab | 45-1010-C | SDS-PAGE em formato 10x10 cm mini-gel. Gel câmara inclui um sistema de refrigeração. |
Para coloidal Coomassie G-250 coloração: | |||
coloração pratos com tampas | VWR | 216-3412 | Se encaixa para mini-géis. Empilhável em shaker. |
sulfato de alumínio-18-hidrato | Merck | 1.01102.5000 | Fizemos melhor experiência com a Merck. Apenas disponível em 5 pacote kg. |
ácido ortofosfórico | Prolabo | 20 624.295 | Vendidas em garrafas de vidro. |
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