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Method Article
该视频应普及胶体考马斯亮蓝G - 250染色协议,根据康等。
考马斯亮蓝(CBB)是常用的SDS - PAGE分离蛋白的可视化,提供一个简单的染色程序和高定量的染料。此外,它是完全兼容与质谱蛋白质鉴定。但尽管有这些优势,CBB被认为是比银或荧光染色法和较不敏感,因此很少用于分析凝胶为基础的蛋白质组学方法检测蛋白质。
已作出了一些改进原来的考马斯协议 1增加CBB灵敏度。两个重大修改,以提高转换成胶体粒子的染料分子的低丰度蛋白质的检测:在1988年,Neuhoff和他的同事们应用到的CBB G - 250基于染色溶液2 20%甲醇和硫酸铵的浓度较高,和2004年Candiano等。建立了蓝银在硫酸铵和甲醇 3在场的CBB G - 250使用磷酸。然而,所有这些修改,只允许约10毫微克蛋白质的检测。一个广泛琐细的协议,胶体考马斯染色康有为等人在2002年发表了他们关于修改Neuhoff胶体CBB染色协议的络合物质。取而代之的硫酸铵,他们用硫酸铝和甲醇毒性较低的乙醇 4取代。的新型铝为基础的染色,在康有为的研究中表现出卓越的灵敏度,可检测低为1毫微克/乐队(磷酸二)与灵敏度变化不大,对蛋白质而定。
在这里,我们展示了康有为的快速和敏感的胶体考马斯亮蓝染色分析目的蛋白的协议的应用程序。我们将说明使用二维凝胶经常在我们的工作小组进行快速和容易的协议。
第1部分:二维(2 - D)凝胶电泳,用杯装
第2部分:胶体考马斯亮CBB G - 250染色
1。染色解决方案
注:染色解决方案的编制,使用分析纯(PA)和高纯度的水,如高品质的微孔系统(Milli - Q水 )的化学品。
考马斯亮解决方案: | 公元2000毫升H 2 O | |
0.02%(W / V) | CBB摹- 250 | 0,4克 |
5%(W / V) | 硫酸铝(14-18)水合物 | 100克 |
10%(V / V) | 乙醇(96%) | 200毫升 |
2%(V / V) | 正磷酸(85%) | 47毫升 |
注:编制染色液的组成部分,按照下列顺序连续此外,要保持:
注:最终的染色解决方案有一个黑暗的绿色,蓝色的外观和充满游泳周围的粒子:
脱色的解决方案: | 公元2000毫升H 2 O | |
10%(V / V) | 乙醇(96%) | 200毫升 |
2%(V / V) | 正磷酸(85%) | 47毫升 |
2。染色过程
第3部分:代表结果
如果按照上述协议,您将获得2 - D凝胶独特的解决和染深蓝色的蛋白质斑点。甚至比2 - D凝胶,银染根据舍甫琴科等 。5,良好的灵敏度和兼容性与质谱的协议,声称,我们实现平等的染色效果。
图1:上述实验的最后结果。康有为的考马斯协议(一)执行强烈如银染, 舍甫琴科等 。(B)在检测后的2 - D凝胶电泳的蛋白质。
第4部分:技巧和窍门
创新或只是另一种考马斯亮协议?
目前存在与考马斯亮蓝染色程序的多个协议。他们大多导致轻微或重大修改Neuhoff和同事2最常用的协议之一。康有为的协议的基础上Neuhoff的公式。但它真的蛋白质组学研究的一个替代的考马斯染色的方法吗?我们将图片的两个主要问题,检测限和可用性,证据表明,它绝对是一个有益的染色协议相比其他考马斯亮协议,甚至银色和荧...
我们感谢为准备和染色1 - D凝胶Nicola博士Wiethölter。
这项工作是由来自德意志研究联合会(GRK 1089/project 5 ND和SM)的资助,由来自于尔根Manchot的研究奖学金基金会于Nd支持。
产品名称 | 公司 | 目录号 | 评论 |
对于IEF和SDS - PAGE电泳: | |||
Immobiline DryStrip凝胶 | GE医疗集团 | 17-6001-94 | 甚至可以使用2年后到期日期。 |
Immobiline DryStrip Reswelling托盘 | GE医疗集团 | 80-6371-84 | 不要用有机溶剂清洗。专为7-18厘米IPG条。 |
Immobiline DryStrip套件 | GE医疗集团 | 18-1004-30 | 包括一个托盘,电极支架,阳极和阴极电极,对准和样品杯酒吧和样品杯。 |
每股盈利3501 XL电源 | GE医疗集团 | 18-1130-05 | 供应电压高达3500 V。 |
Multiphor第二电泳单位 | GE医疗集团 | 18-1018-06 | 移动电极使国际盛事基金在所有长度的IPG胶条(7-24厘米IPG胶条) |
PerfectBlue凝胶体系双人小号 | Peqlab | 45 - 1010 - C | SDS - PAGE电泳在10X10厘米的微型胶格式。凝胶室包括一个冷却系统。 |
胶体考马斯亮蓝G - 250染色: | |||
染色与盖菜 | VWR | 216-3412 | 适合用于小型凝胶。摇床可堆叠。 |
硫酸铝- 18 -水合物 | 默克公司 | 1.01102.5000 | 我们最好与默克公司的经验。刚上市的5公斤包装。 |
磷酸 | Prolabo | 20 624.295 | 玻璃瓶出售。 |
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