JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

إنشاء نموذج الفأر الجرثومي المزمن المصابين الثابتة السالمونيلا الاستعمار التيفية الفأرية في الأمعاء لمدة 27 أسبوعا.

Abstract

البكتيرية نموذج الفأر المصاب نظام نموذجي قوية لدراسة مجالات مثل الالتهابات والعدوى ، وعلم المناعة ، ونقل الإشارة ، وتكون الأورام. وقد اتخذت العديد من الباحثين الاستفادة من الناجم عن التهاب القولون

Protocol

هذا البروتوكول يتضمن ثلاثة أجزاء : الثقافة البكتيرية ، بالتزقيم الماوس ، والكشف عن السالمونيلا.

1. السالمونيلا حالة نمو.

  1. تعد السالمونيلا لوريا ، Bertani مرق (LB) لوحة ، واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
  2. اختيار استنساخ من لوحة ووضعها موضع LB LB 7 مل في أنبوب 12 مل ، ويهز في 37 درجة مئوية لمدة 5 ساعات تقريبا.
  3. تلقيح 50 مل LB مع 0.05 مل من ثقافة المرحلة الثابتة واحتضان على 37 درجة مئوية دون أن تهتز لمدة 18 ساعة تقريبا.
  4. تدور ثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة مع 6000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة ، ووقف البكتيريا في HBSS باستخدام نسبة 100:3 (LB : HBSS). على سبيل المثال :
    وسيتم تعليق كل ثقافة LB 50 مل في HBSS مل 1.5.
  5. لبالتزقيم الحيوانية ، كذلك تمييع ثقافة البكتيرية في نسبة 1:10. على سبيل المثال :
    وسيتم تعليق كل LB 1.5 مل الثقافة في HBSS 15 مل.

2. السالمونيلا عدوى النموذج *.

  1. إعداد الحل الستربتوميسين. وسيتم منح كل من الماوس 7.5 ملغ في 100 الستربتوميسين HBSS ميكرولتر. على سبيل المثال ، تعد حوالي 90 ملغ من الستربتوميسين في 1.2 مل لمدة 10 HBSS الفئران. دائما بعض وحدات التخزين الإضافية عند إعداد حل الستربتوميسين.
  2. سحب المياه والغذاء 4 ساعات قبل العلاج بالتزقيم عن طريق الفم.
  3. بالتزقيم الفئران مع الستربتوميسين مع 7.5 ملغ من ستربتوميسين (100 ميكرولتر من HBSS للسيطرة الفئران). الاستيلاء على الجلد على الكتف الماوس بحزم مع الابهام والاصبع الوسطى ، وتمتد على الرأس والرقبة مع السبابة لجعل المرء على التوالي. توجيه الكرة رأس الإبرة التغذية على طول سقف الفم ، ونحو الجانب الأيمن من الجزء الخلفي من البلعوم ، ثم تمرير برفق الى اسفل المريء وحقن محلول 100 ميكرولتر. وينبغي أن يشعر أي مقاومة.
  4. في 20 ساعة بعد تلقي العلاج الستربتوميسين ، سحب المياه والمواد الغذائية مرة أخرى قبل أن يصاب في الفئران مع البكتيريا.
  5. بالتزقيم كل الفأر مع 100 تعليق ميكرولتر في HBSS أو تعامل مع HBSS العقيمة (مراقبة) بواسطة التغذية عن طريق الفم. الإجراء بالتزقيم هو نفس 2.3) مع الفئران بالتزقيم الستربتوميسين.

وقد أجريت التجارب باستخدام الحيوانات * محددة الممرض خالية C57BL الإناث / 6 الفئران (Taconic ، هدسون ، نيويورك) التي كانت 6-7 أسابيع من العمر كما هو موضح سابقا 1. تمت الموافقة على البروتوكول من جامعة روتشستر جامعة جنة الموارد الحيوانية (UCAR).

3. الكشف عن السالمونيلا في الأمعاء.

  1. جمع الماوس برازي (حوالي 100 ملغ).
  2. نقل عينة البراز إلى 1.5 أنبوب الطرد المركزي صغيرة مع PBS 1ml ودوامة بقوة.
  3. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 800 دورة في الدقيقة. نقل طاف في أنبوب microfuge نظيفة.
  4. الطرد المركزي عند 6000 دورة في الدقيقة ل5min. يتم تجاهل طاف برنامج تلفزيوني و 200 ميكرولتر يضاف إلى الكريات وvortexed.
  5. 200 خط في برنامج تلفزيوني مع ميكرولتر مفرشة الخلية المتاح على طبق من ذهب CHROMagar BBL للكشف عن السالمونيلا. أنواع السالمونيلا تظهر خبازي (رفعت إلى اللون الأرجواني ، انظر Fig.1). إذا غلة 200 ميكرولتر مستعمرات كثيرة جدا على لوحة ، أو استخدام 100 ميكرولتر 50 ميكرولتر لمتتالية.

4. ممثل النتائج.

عندما يتم بشكل صحيح للبروتوكول ، ويمكن الكشف عن السالمونيلا التيفية الفأرية الاستعمار في الأمعاء الماوس أكثر من 6 أشهر. السالمونيلا يمكن الكشف عنها بواسطة البراز الثقافة أكثر من 6 أشهر (Fig.1). ويأتي خارجا نموذجية من هذا الطراز ، فقدان وزن الجسم وفاة تحدث في غضون 4 أسابيع بعد الإصابة. تعتمد على استخدام سلالات السالمونيلا للعدوى ، قد يكون بعض الفئران البقاء على قيد الحياة لا أكثر من 6 أشهر.

figure-protocol-4636
الشكل 1. السالمونيلا المعوية في أنواع السالمونيلا تظهر خبازي (ارتفع إلى الأرجواني) في اللون ، وذلك بسبب الاختلافات في التمثيل الغذائي وجود chromogens المحدد. اما الانواع الاخرى من البكتيريا أو كبح انتاج مستعمرات الأخضر والأزرق أو اللون.

figure-protocol-5046
الشكل 2. نسب بقاء الفئران المصابة بالسالمونيلا سلالة طافرة PhoP ج ، ج PhoP AvrA ، وPhoP AvrA-/AvrA ج + ، ج PhoP AvrA لمدة 4 أسابيع (28 يوما).

وزن الجسم الجدول 1. الفئران المصابة بالسالمونيلا لمدة 4 أسابيع.

0 1 أسبوع 2 أسابيع 3 أسابيع 4 أسابيع
مراقبة 16.78 ± 1.05 16.91 ± 1.28 18.26 ± 1.23 19.31 ± 1.26 20.26 ± 1.15
ج PhoP 16.89 ± 1.03 17.14 ± 1.19 17.43 ± 1.63 * 18.68 ± 1.78 20.05 ± 1.11
ج PhoP AvrA - 16.91 ± 1.12 16.96 ± 1.39 17.06 ± 2.14 ** 18.71 ± 2.18 20.15 ± 1.56
ج + PhoP AvrA-/AvrA 16.94 ± 0.96 17.17 ± 1.02 17.63 ± 1.42 * 18.44 ± 2.03 20.09 ± 1.17

* مقارنة مع مجموعة مراقبة ع <0.05
** مقارنة مع مجموعة مراقبة ع <0.01

الجدول 2. سلالات السالمونيلا المستخدمة في هذه الدراسة.

اسم وصف مرجع أو مصدر
السالمونيلا 14028s البرية من نوع س. التيفية الفأرية ATCC
ج PhoP غير منظم الإمراض معقدة متحولة ميلر وآخرون ، 1990
ج PhoP AvrA - AvrA - الطفرة كولير ، Hyams وآخرون ، 2002
ج + PhoP AvrA-/AvrA ج PhoP AvrA - مع استكمال AvrA ترميز البلازميد كولير ، Hyams وآخرون ، 2002

Discussion

لاستخدام هذا النظام ، فإنه من الضروري للباحث أن تتعلم كيف للتسمين الحيوانات. نحن بالتفصيل منهجية لإعداد ثقافة البكتيرية وبالتزقيم الفئران. علينا أن نبين كيفية مراقبة استمرار السالمونيلا في القناة (GI) الهضمي. الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول بما في ذلك :

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل عن طريق منح جوائز كبيرة DK075386 KO1 وجمعية السرطان الاميركية RSG - 09 - 075 - 01 - MBC لأحد يونيو

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
HBSSSigma-AldrichABCD1234
Luria-Bertani brothBD Biosciences244610
Feeding needlePopper & Sons, Inc.7920
Streptomycin MP Biomedicals100556
BBL CHROMagar SalmonellaBD Biosciences214983
Disposable cell spreadersBiologix Research Company65-1010

References

  1. Duan, Y. beta-Catenin activity negatively regulates bacteria-induced inflammation. Lab Invest. 87 (6), 613-624 (2007).
  2. Barthel, M. Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host. Infection and immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).
  3. Miller, S. I., Mekalanos, J. J. Constitutive expression of the phoP regulon attenuates Salmonella virulence and survival within macrophages. Journal of bacteriology. 172 (5), 2485-2490 (1990).
  4. Valdez, Y. Nramp1 expression by dendritic cells modulates inflammatory responses during Salmonella Typhimurium infection. Cell Microbiol. 10 (8), 1646-1661 (2008).
  5. Woo, H., Okamoto, S., Guiney, D., Gunn, J. S., Fierer, J. A model of Salmonella colitis with features of diarrhea in SLC11A1 wild-type mice. PLoS ONE. 3 (2), e1603-e1603 (2008).
  6. Dangl, J. L. Molecular call-and-response: how Salmonella learns the gospel from its host. Trends Microbiol. 11 (6), 245-246 (2003).
  7. Zaharik, M. L., Vallance, B. A., Puente, J. L., Gros, P., Finlay, B. B. Host-pathogen interactions: Host resistance factor Nramp1 up-regulates the expression of Salmonella pathogenicity island-2 virulence genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 15705-15710 (2002).
  8. Townsend, P., Morton, D. B. Laboratory Animal Care Policies and Regulations: United Kingdom. ILAR J. 37 (2), 68-74 (1995).
  9. Olfert, E. D., Godson, D. L. Humane endpoints for infectious disease animal models. ILAR J. 41 (2), 99-104 (2000).
  10. Ye, Z., Petrof, E. O., Boone, D., Claud, E. C., Sun, J. Salmonella effector AvrA regulation of colonic epithelial cell inflammation by deubiquitination. Am J Pathol. 171 (3), 882-892 (2007).
  11. Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K. S., Vallance, B. A., Finlay, B. B. Chronic enteric salmonella infection in mice leads to severe and persiste nt intestinal fibrosis. Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).
  12. Sukupolvi, S., Edelstein, A., Rhen, M., Normark, S. J., Pfeifer, J. D. Development of a murine model of chronic Salmonella infection. Infection and immunity. 65 (2), 838-842 (1997).
  13. . . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , (2007).
  14. Wu, S., Lu, R., Zhang, Y., Sun, J. Chronic effects of a Salmonella type III secretion effector protein AvrA in vivo. PLoS ONE. , (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

39

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved