Хронический Сальмонеллы Зараженные Модель мыши

Резюме

Создание хронического бактериального инфицированных мышах со стойкими Сальмонеллы Typhimurium колонизации в кишечнике в течение 27 недель.

Аннотация

Бактериальных инфицированных мышах представляет собой мощную систему моделью для изучения таких областях, как инфекции, воспаления, иммунологии, передача сигнала, и опухолей. Многие исследователи воспользовались колит индуцированных

протокол

Этот протокол включает в себя три части: бактериальные культуры, мышь желудочный зонд, и сальмонеллы обнаружения.

1. Сальмонеллы условием роста.

1. Подготовка Salmonella Лурия-Бертани бульон (LB) пластины, инкубировать при температуре 37 ° С в течение ночи.
2. Выберите клона из LB пластины и введены в 7 мл LB в 12 мл трубки, и трясти при 37 ° С в течение примерно 5 часов.
3. Привить 50 мл LB с 0,05 мл стационарная фаза культуры и инкубировать при температуре 37 ° C без встряхивания в течение 18 часов.
4. Спиновые ночь бактериальной культуры при комнатной температуре с 6000 оборотов в минуту в течение 10 минут, приостановить бактерий в HBSS использованием соотношение 100:3 (LB: HBSS). Например:
   Каждые 50 мл LB культуры будет приостановлен в 1,5 HBSS мл.
5. Для животных желудочный зонд, далее разбавленный бактериальные культуры в 1:10. Например:
   Каждый 1,5 мл LB культуры будет приостановлен в 15 мл HBSS.

2. Salmonella-инфекции модели *.

1. Подготовка стрептомицин решение. Каждая мышь будет предоставлена ​​7,5 мг стрептомицина в 100 мкл HBSS. Например, подготовить всего 90 мг стрептомицина в 1,2 мл HBSS в течение 10 мышей. Всегда есть дополнительный объем при подготовке стрептомицин решение.
2. Вывод воды и пищи за 4 часа до устного зонд лечения.
3. Принудительным кормлением мышей с стрептомицина с 7,5 мг стрептомицина (100 мкл HBSS для контрольных мышей). Захватите кожу над мышью плечо крепко большим и средним пальцами, растянуть головы и шеи с указательным пальцем, чтобы сделать пищевода прямо. Прямой шар-кончик иглы кормление по небу и к правой стороне задней стенке глотки, затем аккуратно пройти вниз в пищевод и вводят 100 мкл раствора. Нет сопротивления должно ощущаться.
4. В 20 часов после лечения стрептомицином, изъятые воды и пищи еще раз до мышей, инфицированных бактериями.
5. Желудочный зонд каждой мыши с 100 мкл суспензии в HBSS или обработаны стерильной HBSS (контроля) по устной желудочный зонд. Желудочный зонд процедура такая же, как 2,3) принудительным кормлением мышей с стрептомицин.

Эксперименты * животных проводили с помощью специфических патогенов без женщин C57BL / 6 мышей (Taconic, Гудзон, Нью-Йорк), которые были 6-7 недель, как описано выше ^1. Протокол был одобрен Университета Рочестерского университета комитета по ресурсам животных (UCAR).

3. Обнаружение сальмонелл в кишечнике.

1. Сбор мыши фекальные (около 100 мг).
2. Передача фекальные образца 1,5 микро центрифужную пробирку с 1 мл PBS и вихревые энергично.
3. Центрифуга в течение 10 мин при 800 оборотах в минуту. Передача супернатант в чистую пробирку и отцентрифугировать.
4. Центрифугирования при 6000 оборотов в минуту для 5мин. Супернатант отбрасывается и 200 мкл PBS добавляется в гранулы и встряхивали.
5. Подряд 200 мкл PBS с одноразовыми разбрасыватель ячейку BBL пластины CHROMagar для обнаружения сальмонеллы. Сальмонеллы видов появляются розовато-лиловый (розового до фиолетового, см. Рис.1). Если 200 мкл дает слишком много колоний на пластину, используйте 100 мкл или 50 мкл для полосу.

4. Представитель результаты.

Когда протокол будет сделано правильно, колонизация Salmonella Typhimurium могут быть обнаружены в кишечнике мышей в течение 6 месяцев. Сальмонеллы могут быть обнаружены фекальные культуры в течение 6 месяцев (рис. 1). В качестве типичного из выйдет из этой модели, тело потери веса и смерти происходит в течение 4 недель после инфекции. В зависимости от сальмонеллы штаммы, используемые для инфекции, некоторые мышей могут не выжить в течение 6 месяцев.

Рисунок 1. Кишечные сальмонеллы в Salmonella видов появляются розовато-лиловый (розового до пурпурного) цвета, вследствие метаболических различий в присутствии выбранного хромогенов. Другие бактерии, либо подавляется или производить сине-зеленые или бесцветные колонии.

Рисунок 2. Выживание пропорции мышей, инфицированных сальмонеллой мутантного штамма PhoP ^с, PhoP ^с Авра-и PhoP ^с AvrA-/AvrA +, PhoP ^с Avra в течение 4 недель (28 дней).

Таблица 1. Масса тела мышей, инфицированных сальмонеллой в течение 4 недель.

	0	1 неделя	2-х недель	3 недели	4 недели
контроль	16,78 ± 1,05	16,91 ± 1,28	18,26 ± 1,23	19,31 ± 1,26	20,26 ± 1,15
PhoP с	16,89 ± 1,03	17,14 ± 1,19	17,43 ± 1,63 *	18,68 ± 1,78	20,05 ± 1,11
PhoP с Авра-	16,91 ± 1,12	16,96 ± 1,39	17,06 ± 2,14 **	18,71 ± 2,18	20,15 ± 1,56
PhoP с AvrA-/AvrA +	16,94 ± 0,96	17,17 ± 1,02	17,63 ± 1,42 *	18,44 ± 2,03	20,09 ± 1,17

* По сравнению с контрольной группой р <0,05
** По сравнению с контрольной группой р <0,01

Таблица 2. Сальмонеллы штаммы, используемые в данном исследовании.

Имя	Описание	Ссылка или источник
Сальмонелла 14028s	Дикого типа С. Typhimurium	АТСС
PhoP с	Номера для патогенных комплекса регулятор мутант	Миллер и соавт., 1990
PhoP с Авра-	Авра-мутации	Кольер-Hyams и соавт., 2002
PhoP с AvrA-/AvrA +	PhoP с Авра-плазмиды с дополняемыми Avra кодирования	Кольер-Hyams и соавт., 2002

Обсуждение

Для использования этой системы, это необходимо для исследователя чтобы узнать, как зонд животных. Мы подробно методология подготовки бактериальные культуры и принудительным кормлением мышей. Мы также показываем, как осуществлять мониторинг сальмонеллы настойчивость в желудочн?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Sigma-Aldrich	ABCD1234
Luria-Bertani broth	BD Biosciences	244610
Feeding needle	Popper & Sons, Inc.	7920
Streptomycin	MP Biomedicals	100556
BBL CHROMagar Salmonella	BD Biosciences	214983
Disposable cell spreaders	Biologix Research Company	65-1010