Chronisch Salmonellen Infected Maus-Modell

Zusammenfassung

Stellen Sie eine chronische bakterielle Infektion Mausmodell mit persistierenden Salmonellen Typhimurium Kolonisation im Darm für 27 Wochen.

Zusammenfassung

Die bakterielle Infektion Mausmodell ist ein leistungsfähiges Modell für die Erforschung von Bereichen wie Infektion, Entzündung, Immunologie, Signaltransduktion und Tumorgenese. Viele Forscher haben den Vorteil der Colitis induziert durch genommen

Protokoll

Dieses Protokoll umfasst drei Teile: Bakterienkultur, Maus Magensonde und Nachweis von Salmonellen.

1. Salmonella Wachstum Zustand.

1. Bereiten Sie die Salmonella Luria-Bertani Broth (LB)-Platte, bei 37 ° C über Nacht inkubieren.
2. Wählen Sie einen Klon aus der LB-Platte und in 7 ml LB in einer 12 ml-Tube, und schütteln bei 37 ° C für ca. 5 Stunden.
3. Inoculate 50 ml LB mit 0,05 ml einer stationären Phase der Kultur und bei 37 ° C ohne Schütteln für etwa 18 Stunden.
4. Spin Nacht Bakterienkultur bei Raumtemperatur mit 6000 rpm für 10 Minuten auszusetzen, die Bakterien in HBSS mit Verhältnis 100:3 (LB: HBSS). Zum Beispiel:
   Jede 50 ml LB-Kultur wird in 1,5 ml HBSS suspendiert werden.
5. Für das Tier Magensonde weiter verdünnen, der Bakterienkultur bei 1:10-Verhältnis. Zum Beispiel:
   Jede 1,5 ml LB-Kultur wird in 15 ml HBSS suspendiert werden.

2. Salmonellen-Infektion Modell *.

1. Bereiten Sie den Streptomycin-Lösung. Jede Maus wird 7,5 mg Streptomycin in 100 ul HBSS gegeben werden. Zum Beispiel, bereiten insgesamt 90 mg Streptomycin in 1,2 ml HBSS für 10 Mäuse. Immer etwas mehr Volumen bei der Vorbereitung des Streptomycin-Lösung.
2. Ziehen Sie Wasser und Essen 4 Stunden vor orale Gabe Behandlung.
3. Gavage Mäuse mit Streptomycin mit 7,5 mg Streptomycin (100 ul HBSS für Kontroll-Mäuse). Besorgen Sie sich die Haut über der Maus Schulter fest mit dem Daumen und Mittelfinger, strecken den Kopf und Hals mit dem Zeigefinger an der Speiseröhre gerade machen. Richten Sie die Kugel-Spitze der Fütterung Nadel auf dem Dach des Mundes und auf der rechten Seite der Rückseite des Rachens, dann vorsichtig Pass hinunter in die Speiseröhre und injizieren Sie die 100 ul Lösung. Kein Widerstand sollte zu spüren sein.
4. Bei 20 Stunden nach der Streptomycin-Behandlung, zurückgezogen Wasser und Nahrung wieder, bevor die Mäuse mit Bakterien infiziert sind.
5. Gavage jeder Maus mit 100 ul Suspension in HBSS behandelt oder mit sterilem HBSS (Kontrolle) durch orale Gabe. Die Magensonde Verfahren ist das gleiche wie 2,3) Magensonde Mäuse mit Streptomycin.

* Tierversuche wurden unter Verwendung spezifischer-Pathogen-freien weibliche C57BL / 6 Mäuse (Taconic, Hudson, NY), die 6-7 Wochen alt waren wie zuvor ¹ beschrieben durchgeführt. Das Protokoll wurde von der University of Rochester University Committee on Animal Resources (UCAR) zugelassen.

3. Nachweis von Salmonellen in Darm.

1. Sammeln Sie mit der Maus Kot (ca. 100 mg).
2. Transfer Stuhlprobe in ein 1,5 Mikro-Zentrifugenröhrchen mit 1 ml PBS und kräftig vortexen.
3. Zentrifuge für 10 min bei 800 Umdrehungen pro Minute. Übertragen Sie den Überstand in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen.
4. Zentrifugation bei 6000 rpm für 5min. Überstand wird verworfen und 200 ul PBS ist es, die Pellets zugegeben und gevortext.
5. Streak die 200 ul PBS mit einem Einweg-Zell-Streuer auf einer BBL CHROMagar Platte Salmonellen zu erkennen. Salmonellen erscheinen mauve (rosa bis violett, siehe Abb.1). Wenn 200 ul liefert zu viele Kolonien auf der Platte, verwenden Sie 100 ul oder 50 ul für den Streifen.

4. Repräsentative Ergebnisse.

Wenn das Protokoll korrekt geschehen ist, kann Salmonella typhimurium Kolonisierung in der Maus Darm mehr als 6 Monaten nachgewiesen werden. Salmonellen könnten durch fäkale Kultur über 6 Monate (Abb. 1) festgestellt werden. Als typisches aus diesem Modell kommen, wiegen Körper Verlust und Tod auftreten innerhalb von 4 Wochen nach der Infektion. Abhängig von der Salmonella-Stämme zur Infektion verwendet, können einige Mäuse nicht mehr als 6 Monate überleben.

Abbildung 1. Intestinal Salmonellen in der Salmonella-Spezies erscheinen mauve (rosa bis violett) in Farbe, durch metabolische Unterschiede in der Gegenwart von ausgewählten Chromogene. Andere Bakterien sind entweder gehemmt oder produzieren blau-grüne oder farblose Kolonien.

Abbildung 2. Survival-Anteile von Mäusen mit Salmonella Mutante PhoP ^{c, c} PhoP infiziert Avra-und PhoP ^c AvrA-/AvrA +, PhoP ^c Avra für 4 Wochen (28 Tage).

Tabelle 1. Körpergewicht von Mäusen mit Salmonella für 4 Wochen infiziert.

	0	1 Woche	2 Wochen	3 Wochen	4 Wochen
Kontrolle	16,78 ± 1,05	16,91 ± 1,28	18,26 ± 1,23	19,31 ± 1,26	20,26 ± 1,15
PhoP c	16,89 ± 1,03	17,14 ± 1,19	17,43 ± 1,63 *	18,68 ± 1,78	20,05 ± 1,11
PhoP c Avra-	16,91 ± 1,12	16,96 ± 1,39	17,06 ± 2,14 **	18,71 ± 2,18	20,15 ± 1,56
PhoP c AvrA-/AvrA +	16,94 ± 0,96	17,17 ± 1,02	17,63 ± 1,42 *	18,44 ± 2,03	20,09 ± 1,17

* Im Vergleich zu der Kontrollgruppe p <0,05
** Im Vergleich zu Gruppe p <0,01 Kontrolle

Tabelle 2. Salmonella-Stämme in dieser Studie verwendet.

Name	Beschreibung	Referenz oder Quelle
Salmonella 14028s	Wild-Typ S. typhimurium	ATCC
PhoP c	Non-pathogenen Komplexes Regulator-Mutanten	Miller et al., 1990
PhoP c Avra-	Avra-Mutation	Collier-Hyams et al., 2002
PhoP c AvrA-/AvrA +	PhoP c Avra-mit ergänzt Plasmid kodiert Avra	Collier-Hyams et al., 2002

Diskussion

Zur Nutzung dieses Systems ist es notwendig, für den Forscher lernen, wie man die Tiere eine Magensonde. Wir Detail eine Methodik für die Vorbereitung Bakterienkultur und Magensonde die Mäuse. Wir zeigen auch, wie die Salmonellen Persistenz im Magen-Darm (GI-Trakt) zu überwachen. Die kritischen Schritte in diesem Protokoll einschließlich:

1. Streptomycin-Vorbehandlung: Streptomycin-Vorbehandlung loswerden könnte einige kommensalen Darmflora und machen die Mäuse anfällig für die Infektion mit ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Sigma-Aldrich	ABCD1234
Luria-Bertani broth	BD Biosciences	244610
Feeding needle	Popper & Sons, Inc.	7920
Streptomycin	MP Biomedicals	100556
BBL CHROMagar Salmonella	BD Biosciences	214983
Disposable cell spreaders	Biologix Research Company	65-1010