Kronik Salmonella Infected Fare Modeli

Özet

Kalıcı kronik bakteriyel enfekte fare modelinin oluşturulması Salmonella 27 hafta boyunca bağırsak kolonizasyonu typhimurium.

Özet

Bakteri enfekte fare modelinde, enfeksiyon, enflamasyon, immünoloji, sinyal iletimi, ve tümörogenez gibi alanlarda çalışmak için güçlü bir model sistem. Birçok araştırmacı tarafından uyarılan kolit avantajı almış

Protokol

Bakteri kültürü, fare sonda ve Salmonella tespiti: Bu protokol, üç porsiyon içerir .

1. Salmonella büyüme durumdur.

1. ° C gecede 37 inkübe Salmonella Luria Bertani suyu (LB) plaka hazırlayın.
2. LB plaka seçin ve bir klon, 7 ml LB, 12 ml tüp içine koyun ve 37 ° C'de yaklaşık 5 saat boyunca sallamak.
3. 37 ° C'de yaklaşık 18 saat sallayarak olmadan sabit bir faz kültür ve inkübe 0.05 ml, 50 ml LB inoküle edin.
4. HBSS bakteri oranı 100:3 (HBSS LB) kullanarak askıya alma, 10 dakika boyunca 6000 rpm ile oda sıcaklığında bir gecede bakteri kültürü dönerler. Örneğin:
   Her 50 ml LB kültür, 1.5 ml HBSS askıya alınacaktır.
5. Hayvan gavaj için 1:10 oranında daha fazla bakteri kültürü sulandırmak. Örneğin:
   Her 1.5 ml LB kültür 15 ml HBSS askıya alınacaktır.

2. Salmonella enfeksiyonu modeli *.

1. Streptomisin çözüm hazırlayın. Her fare 100 ul HBSS 7.5 mg streptomisin verilecektir. Örneğin, 10 fareler için 1.2 ml HBSS toplam 90 mg streptomisin hazırlamak. Streptomisin çözümü hazırlarken her zaman bazı ekstra hacim var.
2. 4 saat ağızdan sonda ile tedavi öncesi su ve yiyecek çekin.
3. Streptomisin (100 kontrol fareler için HBSS ul), 7.5 mg streptomisin ile sonda fareler. Işaret parmağı ile baş ve boyun, yemek borusu düz yapmak için streç, fare omzunun üzerinden cilt başparmak ve orta parmağı ile sıkıca tut. Doğrudan çatı boyunca ağız ve yutak arka sağ tarafına doğru beslenme iğne ucu top, sonra yavaşça aşağı özofagus içine geçmesi ve 100 ul çözüm enjekte. Direnç hissedilir olmalıdır.
4. Streptomisin tedavisi, çekilen su ve bakteriler ile enfekte fareler daha önce yemek sonra 20 saat.
5. HBSS 100 ul süspansiyon her fare sonda veya ağızdan sonda ile steril HBSS (kontrol) ile tedavi. Gavaj prosedür streptomisin ile aynı) 2.3 sonda fareler.

* Hayvan deneyleri, özel-patojen-free kadın C57BL / 6 farelerin ^{önceden 1'de} açıklandığı gibi, 6-7 hafta eski (Taconic, Hudson, NY) ile yapıldı . Protokol Hayvan Kaynakları (UÇAR) University of Rochester Üniversitesi Komitesi tarafından onaylandı.

3. Bağırsak Salmonella tespiti.

1. (Yaklaşık 100 mg), fare fekal toplayın.
2. Fekal örnek şiddetle 1ml PBS ve vorteks ile 1.5 mikro santrifüj tüpüne aktarın.
3. 800 rpm'de 10 dakika santrifüj. Süpernatant temiz bir mikrofuge'de boru içine aktarın.
4. 5min için 6000 rpm santrifüj. Süpernatant atılır ve 200 mcL PBS pelet eklendi ve vortekslenmiş.
5. Salmonella tespit etmek için bir BBL CHROMagar plaka üzerinde bir tek hücre dağıtıcısı Streak 200 ul PBS Salmonella (mor gül, Şekil 1) leylak rengi görünür. 200 ul verim Eğer plaka üzerinde bir çok koloniler, 100 ul veya çizgi için 50 ul kullanın.

4. Temsilcisi Sonuçlar.

Protokol doğru yapıldığında, Salmonella typhimurium kolonizasyon 6 ay içinde farenin bağırsak tespit edilebilir. Salmonella 6 ay (Şekil 1) üzerine dışkı kültürü ile tespit edilebilir. Tipik bir çıkış bu model gelir kaybı ve ölüm gibi, vücut 4 hafta enfeksiyonu içinde meydana gelen tartın. Salmonella enfeksiyonu için kullanılan bağlı olarak, bazı fareler hiçbir 6 ay içinde yaşayabilir.

Şekil 1. Bağırsak Salmonella Salmonella seçilen kromojenler varlığı metabolik farklılıklar nedeniyle, renk (mor gül) leylak rengi görünür. Diğer bakteri ya inhibe veya mavi-yeşil renkli veya renksiz koloniler oluşturur.

Şekil 2. Salmonella mutant suşu PhoP ^c, PhoP ^c ile enfekte farelerde Survival oranlarda Avra-ve PhoP ^c AvrA-/AvrA + 4 hafta (28 gün) PhoP ^c Avra.

Tablo 1: 4 hafta boyunca Salmonella ile enfekte farelerde vücut ağırlığı.

	0	1 hafta	2 hafta	3 hafta	4 hafta
kontrol	16.78 ± 1.05	16,91 ± 1,28	18,26 ± 1,23	19.31 ± 1.26	20,26 ± 1,15
PhoP c	16.89 ± 1.03	17.14 ± 1.19	17.43 ± 1.63 *	18.68 ± 1.78	20.05 ± 1.11
PhoP c Avra-	16,91 ± 1.12	16.96 ± 1.39	17.06 ± 2.14 **	18.71 ± 2.18	20.15 ± 1.56
PhoP c AvrA-/AvrA +	16,94 ± 0,96	17.17 ± 1.02	17.63 ± 1.42 *	18,44 ± 2.03	20.09 ± 1.17

* Grup p <0.05 kontrol etmek için karşılaştırıldığında
** Grup p <0.01 kontrol ile karşılaştırıldığında

Tablo 2'de bu çalışmada kullanılan Salmonella.

Isim	Tanım	Referans veya kaynak
Salmonella 14028s	Wild-tip S. typhimurium	ATCC
PhoP c	Mutant patojen olmayan karmaşık regülatörü	Miller ve ark, 1990
PhoP c Avra-	Avra-mutasyon	Collier-Hyams ve ark, 2002
PhoP c AvrA-/AvrA +	PhoP c tamamlanmaktadır plazmid kodlama Avra Avra-	Collier-Hyams ve ark, 2002

Tartışmalar

To use this system, it is necessary for the researcher to learn how to gavage the animals. We detail a methodology for prepare bacterial culture and gavage the mice. We also show how to monitor the Salmonella persistence in the gastrointestinal (GI) tract. The critical steps in this protocol including:

1. Streptomycin-pretreatment: Streptomycin-pretreatment could get rid of some commensal gut flora and make the mice susceptible to the Salmonella infection².
2. Salmonell...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Sigma-Aldrich	ABCD1234
Luria-Bertani broth	BD Biosciences	244610
Feeding needle	Popper & Sons, Inc.	7920
Streptomycin	MP Biomedicals	100556
BBL CHROMagar Salmonella	BD Biosciences	214983
Disposable cell spreaders	Biologix Research Company	65-1010