من التنميط المسبق الجزئي الرناوات و microRNAs باستخدام الكمية في الوقت الحقيقي PCR (qPCR) صالحة

Summary

وسوف نظهر الإعداد وتحليل microRNA - 96 - جيدا قبل صفائف QPCR باستخدام الروبوت وكذلك جنب مع ماصة العلمية الحرارية الأقنية ماتريكس.

Abstract

وقد برزت الكمي في الوقت الحقيقي PCR (QPCR) كأداة قيمة ودقيقة في توصيف مستويات التعبير الجيني. واحدة من مزاياها العديدة هو الحد الأدنى للكشف بالمقارنة مع غيرها من أساليب التعبير الجيني التنميط أثناء استخدام كميات صغيرة من المدخلات لكل مقايسة. وقد تحسنت الآلي qPCR الإعداد هذا المجال من خلال السماح لمزيد من التكاثر. الإعداد لها مريحة وسريعة تتيح للتجارب التي مرت عالية ، مما مكن من التنميط جينات كثيرة مختلفة في وقت واحد في كل تجربة. هذا الأسلوب مع لوحة التحكم الداخلية يقلل أيضا من المتغيرات التجريبية المشتركة لتقنيات أخرى. قمنا بتطويرها مؤخرا لفحص qPCR التنميط المسبق من microRNAs (ما قبل miRNAs) باستخدام مجموعة من أزواج التمهيدي 186. ظهرت MicroRNAs كطبقة رواية صغيرة ، الرناوات غير الترميز لديهم القدرة على تنظيم العديد من الأهداف مرنا في مرحلة ما بعد النسخي. وكتب أولا هذه الرنا RNA الصغيرة بوليميريز الثاني باعتباره ميرنا الابتدائي (الحزب الثوري المؤسسي ، ميرنا) نسخة ، وهو المشقوق ثم إلى ميرنا السلائف (ما قبل ميرنا). ويتم تصدير ما قبل miRNAs إلى السيتوبلازم حيث يشق المقامر حلقة منعطف حاد لانتاج miRNAs ناضجة. ويمكن ملاحظة زيادة في مستويات ميرنا على السلائف وعلى صعيد ميرنا ناضجة والتنميط من كل من هذه الأشكال يمكن أن تكون مفيدة. هناك عدة فحوصات متوفرة تجاريا للmiRNAs ناضجة ، ولكن تكلفتها العالية قد تردع هذه التقنية الباحثين من التنميط. هنا ، نحن نناقش فعالة من حيث التكلفة وموثوق بها ، وطريقة qPCR SYBR القائمة على التنميط المسبق miRNAs. التغيرات في مستويات ما قبل ميرنا غالبا ما تعكس التغييرات ميرنا ناضجة ويمكن أن تكون مؤشرا مفيدا التعبير ميرنا ناضجة. ومع ذلك ، قد التنميط المتزامن لكلا miRNAs قبل أن تنضج وmiRNAs الأمثل لأنها يمكن أن تساهم المعلومات nonredundant وتوفير نظرة ثاقبة تجهيز microRNA. وعلاوة على ذلك ، يمكن توسيع هذه التقنية وصفها هنا ليشمل مجموعات من التنميط مكتبة أخرى لمسارات محددة أو مسببات الأمراض.

Protocol

يمكن تعيين صفائف qPCR التنميط المسبق على النحو ميرنا مؤتمتة بالكامل مع الروبوت Tecan ايفو الحرية (A) أو باليد مع مصفوفة متعددة ماصة الإلكترونية (B).

1) تحضير مزيج الرئيسي ، لوحات التمهيدي والعينات.

1. يجب أن يتم تخزين لوحات تحتوي على أزواج التمهيدي التمهيدي 96 - 186 في شكل جيد (ما مجموعه 2 لوحات) في 12:05 في درجة مئوية -80 لوحات من ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة ، ودوامة لفترة وجيزة قبل استخدام أجهزة الطرد المركزي.
2. لتحضير مزيج رئيسي ، إلى تحسن SYBR الأخضر ميكس PCR 2X في درجة حرارة الغرفة. كل رد فعل يستخدم مزيج 8ul رئيسية مع 2ul التمهيدي. تكوين مزيج الرئيسي في رد الفعل هو مزيج 4ul SYBR ، 3ul المياه الصف PCR و 10-20 نانوغرام عينة الحمض النووي أو [كدنا].
3. لإعداد كل طبق التمهيدي 96 - جيدا ، سوف تحتاج إلى أربعة أنابيب مزيج الرئيسي. يمكن تشغيل عينات 4 عينات في لوحة (singlicate) ، و 2 في عينات لوحة (مكرر) أو عينة واحدة في quadruplicate.
4. تحضير مزيج الماجستير من خلال الجمع بين SYBR والماء والعينة في كل من أنابيب إيبندورف 4 - 2ml. وينبغي أن تحتوي على ما يكفي من كل أنبوب رئيسي لمزج ما يقرب من 100 ردود الفعل ، مما يسمح للفائض pipetting النفايات. الدوامة إلى المزيج.

A. الإعداد من قبل ميرنا الرزن باستخدام Tecan الحرية ايفو الروبوت.

1. بعد التهيئة للروبوت وتحميل البرنامج Evoware ، دافق ثلاث مرات مع كل 30mls لمسح نظام فقاعات الهواء التي من شأنها أن تتداخل مع pipetting الدقة.
2. الإعداد منصة الروبوت لتشمل ما يلي :
   • 384 المسمى كذلك لوحة
   • 96 - جيدا وحة التمهيدي (1)
   • سيد يمزج
   • التبييض التي تحتوي على حوض 2 ٪
   • ألف حاوية مملوءة نظام السوائل
   • نفايات الحاويات الفارغة
3. بدء تشغيل الروبوت الآلي عن طريق اختيار "تشغيل" مرتين.
4. في نهاية البرنامج ، وإزالة 384 لوحة وكذلك مع ختم احباط الختم LightCycler 480 والطرد المركزي لفترة وجيزة. مختومة مكان لوحة 384 في موقف جيد 1 من الفندق.
5. انتقل إلى الخطوة 2.2 و تكرار لوحة التمهيدي 2 مع يمزج رئيسية جديدة لوحة جديدة و384 أيضا.
   1. مكان لوحة مختومة في موقف 2 من الفندق.
6. فتح برنامج جديد لتحميل Evoware في Lightcycler من الفندق وحدد "تشغيل" مرتين.
   1. والحرية ايفو تلقائيا تحميل كل لوحة في LightCycler وتشغيل البرنامج التالي الدراجات SYBR الأخضر الأول / HRM :
      قبل (1 دورة) :
      50 درجة لمدة 5 دقائق في معدل زيادة قدرها 4.8 درجة / ثانية
      95 درجة لمدة 5 دقائق في معدل زيادة قدرها 4.8 درجة / ثانية
      أمبير (45 دورات) :
      95 درجة لمدة 15 ثانية في معدل زيادة قدرها 4.8 درجة / ثانية
      62 درجة لمدة 30 ثانية في معدل زيادة قدره 2.5 درجة / ثانية
      (واحدة الحصول على البيانات خلال هذه الخطوة)
      ذوبان منحنى :
      95 درجة لمدة 5 ثوانى على معدل زيادة قدرها 4.8 درجة / ثانية
      60 درجة لمدة 1 دقيقة بمعدل المنحدر من 2.5 درجة / ثانية
      95 درجة المستمر في معدل زيادة من 0.11 درجة / ثانية
      مع 5 درجة مئوية في عمليات الاستحواذ
      باردة :
      50 درجة لمدة 30 ثانية بمعدل المنحدر من 25 درجة / ثانية

باء الإعداد من قبل ميرنا الرزن باستخدام ماصة مصفوفة متعددة الإلكترونية :

1. محتويات مكان الانبوب الرئيسي مزيج 1 في المكمن.
2. تعيين ماصة الالكترونية لنضح 16ul مزيج رئيسية مع 8ul - 2 الاستغناء عن الخطوات تليها خطوة تطهير.
3. لمزيج الرئيسي 1 ، الاستغناء 8ul في كل جانب الآخر من اللوحة 384 جيدا (على تعيين 384 جيدا تباعد غيض) ، بدءا A1 جيدا. (أي الآبار A1 ، C1 ، E1 ، الخ) ل8ul second الاستغناء والانتقال إلى العمود 3 (أي الآبار A3 ، C3 ، E3 ، الخ) ، ثم تطهير أكثر من حاوية النفايات والتخلص منها نصائح.
4. تتبع هذا النمط لدورات 5 المتبقية حتى تصل A23 أيضا.
5. تكرار لمزيج الرئيسي 2 ، (A2 مع بداية جيدة ، C2 ، E2 ، الخ) ؛ الرئيسي مزيج 3 (B1 في بداية جيدة ، D1 ، F1 ، الخ) ؛ الرئيسي مزيج 4 (في بداية B2 ، D2 ، F2 ، الخ. .)
6. لوحة من aliquotting التمهيدي ، تعيين ماصة الالكترونية لنضح 2ul والاستغناء 2ul مع تطهير التالية الخطوة. الاستغناء 2ul من المشارع من العمود 1 من 96 لوحة جيدا التمهيدي (ه) في لوحة 384 جيدا ، والآبار A1 ، C1 ، E1 ، الخ إزالة أكثر من حاوية النفايات والتخلص منها نصائح. كرر لA2 الآبار ، C2 ، E2 ؛ B1 ، D1 ، F1 ؛ و B2 ، D2 ، F2 ، الخ.
7. تكرار للصفوف من 2-12 الاشعال 96 - جيدا ، وتتحرك على كل الأعمدة 2 لكل عمود التمهيدي ، حتى تم aliquotted كامل جيدا 384 لوحة.
8. لوحات الختم مع ختم احباط LightCycler وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة.
9. لوحات المكان الى LightCycler 480 ودورة لوحات وفقا للإعدادات التالية باستخدام الخضراء SYBR I / HRM تنسيق الكشف :
   قبل (1 دورة) :
   50 درجة لمدة 5 دقائق في معدل زيادة قدرها 4.8 درجة / ثانية
   95 درجة لمدة 5 دقائق في معدل زيادة قدرها 4.8 درجة / ثانية
   أمبير (45 دورات) :
   95 درجة لمدة 15 ثانية بمعدل المنحدرمن 4.8 ° / ثانية
   62 درجة لمدة 30 ثانية في معدل زيادة قدره 2.5 درجة / ثانية
   (واحدة الحصول على البيانات خلال هذه الخطوة)
   ذوبان منحنى :
   95 درجة لمدة 5 ثوانى على معدل زيادة قدرها 4.8 درجة / ثانية
   60 درجة لمدة 1 دقيقة بمعدل المنحدر من 2.5 درجة / ثانية
   95 درجة المستمر في معدل زيادة من 0.11 درجة / ثانية
   مع 5 درجة مئوية في عمليات الاستحواذ
   باردة :
   50 درجة لمدة 30 ثانية بمعدل المنحدر من 25 درجة / ثانية
10. تكرار استخدام لوحة التمهيدي 2 ، aliquotting في لوحة جديدة 384 يمزج جيدا باستخدام الرئيسي الطازجة.

أسرار النجاح :

سمة هامة عند تصميم صفائف PCR هو أن جميع أزواج التمهيدي 186 ونفس درجة الحرارة الصلب ، بحيث يمكن تشغيل لوحة في نفس الإعدادات المثلى PCR تشغيل البرنامج.

يجب فحص كل مجموعة ثلاثة عناصر تحكم جديدة باستخدام عينات قبل التشغيل. هذه الضوابط هي :
1 تشغيل جميع أجهزة الاشعال تشغيل مع الماء أو 0.1 TE x لاستبعاد احتمال حدوث تلوث التمهيدي.
1 يركض من المياه بالتناوب / TE والتحكم إيجابية ، لضمان عدم وجود المرحلة.
3 يعمل باستخدام نفس عنصر التحكم إيجابية ، لضمان تكرارية بين تشغيله.
وينبغي أن يمزج الرئيسي الطازجة ، ويجب تشغيل لوحات في غضون 24 ساعة من أجل تحقيق النتائج المثلى
يجب إزالة التمهيدي لوحة احباط ببطء للحد من مخاطر التلوث بين الآبار.
عند استخدام الروبوت مع نصائح محددة ، 2 ٪ غسل التبييض هو ضروري لغسل نصائح pipetting بين كل خطوة ، يليه تدفق المياه. هذا يمنع ويزيل المرحل ، والتي يمكن أن تلوث خلاف البيانات وتؤدي إلى نتائج غير حاسمة.
بعد تشغيل لوحة من خلال Lightcycler ، لا ينبغي أن يكون فتحها مرة أخرى في غرفة الإعداد PCR. هذا يساعد على منع التلوث PCR.

ممثل النتائج :

تمثل عادة نتائج qPCR بالقيم CT كما هو محدد من برامج التحليل Lightcycler. A تشغيل الناجحة عادة ما تتألف من مجموعة من CTS للعينات ، وعادة ما بين 20-35 لعينات إيجابية. عينات المياه في تشغيل جيدة دائما في CT من> 40 وتعتبر أي عينات أو الآبار الخاصة مع أكثر من 37 CT سلبية أو لا تكتشف. وكقاعدة عامة ، مما أسفر عن عينات من CT <10 كما لا يمكن الاعتماد عليها ويتم استبعادها من مزيد من التحليل. هناك عدة طرق لتحليل البيانات qPCR وإدراج الضوابط الداخلية في مقايسة لدينا يساعد على التحكم عن اختلاف المدخلات العينة. الصفيف قبل مير يتضمن السيطرة U6 التمهيدي ، والذي يستخدم غالبا ما الجين اشارة الى تطبيع القيم CT من عينات مختلفة. ويشار إلى هذه القيمة لتطبيع كقيمة CT الدلتا (DCT). غالبا ما يتم رسم النتائج كما CT الخام ، قيمة DCT أو يمكن لمزيد من التحليل للقيم موحدة.

في الشكل 1 ، ويقدم تحليلا للمجموعة قبل microRNA كاملة مدتها أربع عينات مختلفة من تجربة timecourse في شكل خريطة للحرارة. يظهر التعبير النسبية لكل microRNA قبل وبرزت ثلاثة رئيسية ، مجموعات متميزة. وخضع معظم ما قبل ميرس تحليل الصغيرة ، والتغيرات ضئيلة كما هو متوقع (الشكل 1A). ومع ذلك ، كانت انخفضت بشكل ملحوظ على جزء صغير من microRNAs المسبق (1B الشكل) أو زيادة كبيرة (الشكل 1C) في كافة مراحل التجربة timecourse. وكانت مستويات طبيعية للتعبير عن كل microRNA مسبقا لtimepoint 0h (نموذج 1) وعلى مستوى خط الأساس. في بعض الحالات ، قد لاحظ أن بعض microRNAs قبل كتلة عنقودية معا أيضا في التحليل heatmap (مثلا : اسمحوا - 7A 1B الشكل ،). اعتمادا على التجربة ، قد تنشأ كتل التي تعتمد على العدوى الفيروسية ، الخلية نوع معين من التعبير microRNAs ما قبل أو ما قبل ميرس التي ينظمها جزيء مشتركة أو إشارات الطريق.

وفحص ما قبل microRNA الذي قمنا بتطويره أيضا يضم عددا من المعروف الفيروسية microRNAs المسبق والجينات المشفرة بواسطة ساركومة كابوزي المرتبطين الفيروسة (KSHV) وفيروس ابشتاين بار (EBV) بالإضافة إلى ميرس قبل الإنسان. ويمكن استخدام هذه الضوابط على النحو إيجابية أو سلبية ، اعتمادا على خط الخلية ووضعها الفيروسية للعينات المستخدمة. في الشكل 2 ، وتظهر التجارة في الخدمات في المتوسط ​​من عينة KSHV سلبية في المدى quadruplicate. الأهم من ذلك ، لم يتم الكشف عن KSHV لنا في هذه العينة من قبل مجموعة qPCR حساسة للغاية. ومع ذلك ، U6 -- وأعرب عن بالغ التأثير وأعرب قبل microRNA ، على المستويات التي يمكن اكتشافها -- سيطرتنا الداخلية والسماح 7A. في النهاية ، كما فعل متوقع ، سيطرة سلبية من PCR الصف المياه لم تسفر منتج qPCR.

مؤشر آخر لتشغيل qPCR الناجح هو منحنى ذوبان جيدة التحليل ، والتي يمكن أن تعطي فكرة عن تلوث محتمل في العينات. لإنشاء درجة حرارة انصهار ، يسخن لوحة ببطء بعد اكتمال PCR. كما الحمض النووي مسارات منفصلة ، ويتم تحريرها SYBR الخضراء ، والنقصان إشارة مضان. درجة الحرارة في هذا الدكتور الذيالمرجع يحدث هو المجدولة ، وكما هو معروف في درجة حرارة انصهار العينة. تبعا لتسلسل الحمض النووي ، وعينات تذوب في درجات حرارة مختلفة عن بعضها البعض ، والتحكم في المياه من السلبية ، والتي لا ينبغي أن يكون على درجة حرارة ذوبان نظرا لعدم وجود الحمض النووي. ينبغي للمنتجات PCR من كل زوج التمهيدي تذوب في درجات حرارة مماثلة. على سبيل المثال ، يوضح الشكل (3) تحليل منحنى ذوبان لمدة الاشعال مختلفة باستخدام نفس العينة في مكررة. فمن الواضح أن درجة حرارة انصهار هو مختلف عن أزواج التمهيدي اثنين ولكن العينة في درجة حرارة انصهار نفسه بالضبط لكل تكرار. قد دلائل على وجود نموذج سيء أو يحتمل أن تكون ملوثة وتشمل ذوبان قمم عدة ، مما يشير إلى وجود اثنين من مصادر مختلفة من المدخلات.

الشكل 1. التمهيدية microRNA التواقيع يظهر عن طريق استخدام التنميط القائم على رواية qPCR الصفيف. تم احتساب متوسط ​​deltaCTU6 وحملت قيم موحدة في صناعة البرمجيات ArrayMinerTM ، مما أسفر عن 3 مجموعات متميزة كما هو معروض heatmaps. (أ) تظهر قبل microRNAs مع تغييرات طفيفة في التعبير. قبل microRNAs التي انخفضت بشكل ملحوظ المستويات كانت (B) أو (ج) زيادة وتبين ايضا. الأزرق يقابل انخفاض مستويات التعبير ، بينما يمثل الحمراء زيادة مستويات التعبير.

الشكل 2. إدراج الضوابط الداخلية في الصفيف قبل microRNA qPCR مقرا لها. وتظهر القيم CT الخام لمدة 3 جينات مختلفة والتحكم قالب لا. كما يستخدم U6 سيطرة على الإيجابية الداخلية بينما PCR H2O بمثابة سيطرتنا سلبية. اسمحوا - 7A - 1 - 1 هو microRNA يعبر عنها عادة في كثير من أنواع مختلفة من الخلايا ، بينما يمكن استخدام KSHV LANA والسيطرة إما إيجابية أو سلبية ، على أساس الحالة الفيروسية من خط الخلية أو النسيج المستخدمة.

الشكل 3. تحليل الانصهار ذروة ما قبل microRNA الاشعال وعدم وجود تلوث العينة. تم الحصول على منحنيات الذوبان باستخدام التحليل يدعو تيم LightCycler في البرنامج. وترد اثنين الاشعال المختلفة (التمهيدي A و B) لتشغيل في نفس العينة مكررة. درجة حرارة انصهار لكل التمهيدي هو واضح. ومع ذلك ، نموذج واحد فقط الذروة ، مما يدل على عدم وجود تلوث العينة.

Discussion

QPCR هو مقايسة حساسة للغاية والتي يمكن استخدامها للمقارنة بين مستويات التعبير الجيني بين العينات في الدراسة ، وكذلك لتحديد بالفيروس في حالة من الفيروسات. الفائدة من استخدام صفائف qPCR هو القدرة على تشغيل العديد من المشارع (في حالتنا ، أزواج التمهيدي 186) لكل عينة في فترة ق...

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Freedom Evo 150		Tecan	30017587
Matrix Electronic Multichannel Pipette		Thermo Scientific	2001-MTX	(or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above)
Matrix Integrity Filter Tips, Sterile		Thermo Scientific	7435	(or comparable tip for multichannel used)
Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master		Roche	04 707 516 001
Lightcycler 480 Instrument II		Roche	05015243001	384-well version
Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white		Roche	04729749001
LightCycler 480 Sealing Foil		Roche	04729757001
LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software		Roche	05075122001
Eliminase Decontaminant		Decon Laboratories	04-355-31