Perfiles de Pre-micro ARN y microRNAs utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) Arrays

Resumen

Vamos a demostrar la configuración y el análisis de pre-microRNA-96 y las matrices de QPCR utilizando un robot, así como con la mano con una pipeta de Thermo Scientific multicanal Matrix.

Resumen

Cuantitativa en tiempo real PCR (QPCR) se ha convertido en una herramienta precisa y valiosa en los perfiles de los niveles de expresión génica. Una de sus muchas ventajas es un menor límite de detección en comparación con otros métodos de perfiles de expresión génica durante el uso de pequeñas cantidades de entrada para cada ensayo. Automatizado de configuración qPCR ha mejorado este campo, al permitir una mayor reproducibilidad. Su configuración permite una rápida y conveniente para experimentos de alto rendimiento, lo que permite determinar las características de muchos genes diferentes al mismo tiempo en cada experimento. Este método junto con los controles internos de la placa también reduce las variables experimentales comunes a otras técnicas. Recientemente hemos desarrollado un ensayo qPCR para la elaboración de perfiles de pre-microRNAs (pre-miRNAs) usando un conjunto de 186 pares de cebadores. Los microARNs se han convertido en una nueva clase de pequeños ARN no codificantes con la capacidad de regular muchas de las metas de mRNA en el nivel post-transcripcional. Estos ARN pequeños se transcribe primero por la ARN polimerasa II como un miRNA primaria (pri-miRNA) transcripción, que se escinde en el miARN precursor (pre-miRNA). Pre-miRNAs se exportan al citoplasma, donde Dicer corta la horquilla para producir miRNAs maduros. Los aumentos en los niveles de miRNA se puede observar tanto en el precursor y los niveles de miRNA maduros y el perfil de estas dos formas pueden ser útiles. Hay varias pruebas disponibles en el mercado de miRNAs maduros, sin embargo, su alto costo puede disuadir a los investigadores de esta técnica de perfiles. En este caso, hablamos de un costo-efectiva, confiable, basado en el método SYBR qPCR de los perfiles pre-miRNAs. Cambios en los niveles pre-miRNA maduros suelen reflejar los cambios miRNA y puede ser un indicador útil de la expresión de miRNA maduros. Sin embargo, el perfil simultánea de ambos pre-miRNAs y miRNAs maduros puede ser óptimo, ya que pueden aportar información redundante y proporcionar información sobre el procesamiento de microARN. Además, la técnica descrita aquí se puede ampliar para abarcar la elaboración de perfiles de grupos de otras bibliotecas de vías específicas o patógenos.

Protocolo

El qPCR pre-miRNA matrices de perfiles se pueden configurar como totalmente automatizada con un robot Tecan Libertad Evo (A) oa mano con la pipeta multicanal electrónica Matrix (B).

1) Prepare la mezcla maestra, placas de imprimación y muestras.

1. Primer placas que contienen 186 pares de cebadores en formato de 96 pocillos (un total de 2 placas) en 24:05 deben ser almacenados a -80 ° C. Placas de descongelar a temperatura ambiente, mezclar y centrifugar brevemente antes de su uso.
2. Para preparar la mezcla maestra, descongele SYBR Green 2x Mix PCR a temperatura ambiente. Cada reacción utiliza mezcla maestra 8ul con imprim....

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Discusión

QPCR es un ensayo muy sensible que puede ser utilizado para comparar los niveles de expresión genética entre las muestras en un estudio, así como para determinar la positividad en el caso de los virus. La ventaja de utilizar matrices de qPCR es la capacidad de ejecutar muchos primers (en nuestro caso, 186 pares de cebadores) para cada muestra en un corto período de tiempo. El uso de un robot de pipeteado como el Evo Tecan la libertad, la cantidad de tiempo necesario para establecer un experimento hasta pueden reduci.......

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Freedom Evo 150	Tecan Group Ltd.	30017587
Matrix Electronic Multichannel Pipette	Thermo Fisher Scientific, Inc.	2001-MTX	(or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above)
Matrix Integrity Filter Tips, Sterile	Thermo Fisher Scientific, Inc.	7435	(or comparable tip for multichannel used)
Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master	Roche Group	04 707 516 001
Lightcycler 480 Instrument II	Roche Group	05015243001	384-well version
Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white	Roche Group	04729749001
LightCycler 480 Sealing Foil	Roche Group	04729757001
LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software	Roche Group	05075122001
Eliminase Decontaminant	Decon Laboratories	04-355-31