分析的预微RNA和小分子RNA采用实时定量PCR（定量PCR）阵列

摘要

我们将演示前的小分子RNA的设置和分析QPCR 96孔阵列以及使用机器人手用Thermo Scientific的矩阵多道移液器。

摘要

实时定量PCR（QPCR）已成为一个准确和有价值的工具，在分析基因表达水平。它的诸多优点之一，是一个较低的检测限相比，基因表达分析等方法，同时使用，每个检测数额较小的输入。自动定量PCR安装更大的可重复性，从而改善了这一领域。它的方便和快速设置允许用于高通量实验，使许多不同的基因分析，同时在每个实验。这连同内部板控制的方法，也降低了其他技术的共同实验变量。我们最近开发的一个前小分子RNA分析的定量PCR检测（前- miRNA的），使用186个引物对。小分子RNA已成为一类新的小，非编码RNA的调节能力，在许多基因的转录后水平的目标。作为一个主要的miRNA（PRI - miRNA）的成绩单，然后到前体miRNA（预miRNA）的切割，这些小分子RNA是由RNA聚合酶Ⅱ转录。预miRNA是出口到细胞质中Dicer酶切割产生成熟的miRNA发夹环。在miRNA水平的提高，可以观察到的前体和成熟的miRNA的水平都和这两种形式分析是有用的。有几种市售成熟的miRNA的检测，但其成本高，可能会阻止从这个分析技术的研究人员。在这里，我们讨论了一个具有成本效益，可靠的分析前的miRNA，基于SYBR的qPCR的方法。 miRNA的前水平的变化往往反映了成熟miRNA的变化和成熟的miRNA的表达可以是一个有用的指标。然而，同时分析前的miRNA和成熟的miRNA可能是最佳的，因为他们可以作出贡献的非冗余信息，并提供处理成小分子RNA的见解。此外，这里描述的技术可以扩展，包括具体途​​径或病原体的其他库集的分析。

研究方案

qPCR的预miRNA表达谱阵列，可以成立一个特餐自由埃沃机器人（A）或手与基体的电子多道移液器（二）充分自动化。

1）准备主结构，引板和样品。

1. 底漆板含有186个引物对96孔板格式在下午12时05分（共2板），应储存在-80 ° C解冻板在室温下，旋涡和离心机使用前简要。
2. 要准备的主结构，SYBR绿色2X PCR混合物在室温下解冻。每个反应使用2ul底漆8ul预混。每个反应的主结构的组成是4UL SYBR组合，3ul PCR级水和10-20吴样本DNA或cDNA。
3. 每96底漆板的设置，四大高手混合管是必要的。样品可以运行4个样本（singlicate）每盘，每盘2个样本（复印件）或单个样品一式四份。
4. 准备42毫升Eppendorf管相结合的SYBR，水和样品的主结构。每个管应包含足够的预混约100反应，让多余的废物吹打。涡旋混合。

A.安装前的miRNA使用自由特餐埃沃机器人的实验。

1. 机器人和加载的Evoware程序初始化后，30mls每个冲洗三次，以清除气泡会干扰移液精度系统。
2. 安装的机器人平台，包括以下内容：
   • 标记384孔板
   • 96孔引物板（1）
   • 主混音
   • 含有2％的漂白粉低谷
   • 一个充满制度液容器
   • 空废物容器
3. 首先，选择“运行”两次自动机器人运行。
4. 在节目结束时，删除的LightCycler 480密封箔384孔板和密封，并短暂离心​​。酒店的位置1处密封384孔板。
5. 转到步骤2.2和底漆板2，与新的主混合和一个新的384孔板的重复。
   1. 密封板放置在酒店的位置2。
6. 打开新Evoware程序加载从酒店在LightCycler，并选择“运行”两次。
   1. 自由埃沃将自动加载到每个板块的LightCycler，并运行以下的SYBR绿色的I /人力资源管理循环程序：
      前（1个周期）：
      50 ° 5分钟斜率4.8 ° /秒
      95 ° 5分钟斜率4.8 ° /秒
      放大器（45个循环）：
      15秒95 °斜率4.8 ° /秒
      30秒62 °斜率2.5 ° /秒
      （在此步骤中的单个数据采集）
      熔点曲线：
      5秒，95 °斜率4.8 ° /秒
      60℃1分钟斜率2.5 ° /秒
      95 °持续升温速率为0.11 ° /秒
      5收购每° C
      酷：
      30秒50 °斜率25 ° /秒

B.安装前miRNA的检测使用矩阵电子多道移液器：

1. 预混1到水库管放置的内容。
2. 设置电子移液器吸16ul 2 - 8ul预混免除吹扫步骤遵循的步骤。
3. 对于预混1，分配到每一个其他的384孔板（384孔尖间距设置）以及8ul，孔A1开始。 （即孔A1，C1，E1等），对于第二8ul免除，移动到第3列（即井A3，C3，E3，等），然后通过一个废物容器的清除和处理技巧。
4. 其余5个周期，按照这种模式，直到您到达以及A23。
5. 重复的master mix 2，（开头以及A2，C2，E2，等等）;预混3（孔B1，D1，F1等开始）;预混4（开始在B2，D2，F2键等。）
6. 对于引物板aliquotting，设置电子移液器吸2ul并免除2ul与清除步骤如下。到384孔板，孔A1，C1，E1等在一个废物容器的清除和处理技巧，免除从96孔底漆板（AH）的第1列的引物2ul。重复井A2，C2，E2，B1，D1，F1;和B2，D2，F2键等。
7. 重复2-12行96引物，引物各列，每2列移动，直到全部384孔板已aliquotted。
8. 与LightCycler配套的密封铝箔和离心密封板。
9. 进入一个的LightCycler 480和周期的板块，按照以下设置使用SYBR GREEN I /人力资源管理检测格式板：
   前（1个周期）：
   50 ° 5分钟斜率4.8 ° /秒
   95 ° 5分钟斜率4.8 ° /秒
   安培（45个循环）：
   在升温速率为15秒95 °4.8 ° /秒
   30秒62 °斜率2.5 ° /秒
   （在此步骤中的单个数据采集）
   熔点曲线：
   5秒95 °斜率4.8 ° /秒
   60℃1分钟斜率2.5 ° /秒
   95 °持续升温速率为0.11 ° /秒
   5收购每° C
   酷：
   30秒50 °斜率25 ° /秒
10. 重复使用底漆板2，使用新鲜配制的主混合到一个新的384盘aliquotting。

成功秘诀：

设计PCR扩增阵列时的一个重要特点是，所有186个引物对具有相同的退火温度，使板可运行在同样的最佳PCR运行的程序设置。

使用三个控件在运行样品前，应检查每一个新的数组。这些控制包括：
1运行与运行，以排除引物污染的水或0.1 x TE所有引物。
运行交替水/ TE和阳性对照，以确保无交叉污染。
3运行使用相同的阳性对照，以确保运行之间的可重复性。
主混音应新鲜配制，板应在24小时内运行，以获得最佳效果
应去除引物板箔，慢慢井间的污染，以减少风险。
在使用机器人与固定提示时，2％的漂白粉洗，洗彼此之间移液步骤的提示，通过用水冲洗是必要的。这样可以防止和消除结转，否则可能污染数据，导致不确定的结果。
后板是通过在LightCycler上运行，它不应该再次被打开的PCR设置房间。这有助于防止污染的PCR。

代表性的成果：

qPCR的结果通常是代表在LightCycler分析软件确定CT值。通常包括积极为样本，样品，通常介于20-35的CT范围的成功运行。水样在一个良好的运行总是在> 40 CT和任何样品或与CT的具体井超过37被认为是负面的，或者未检出。作为一般规则，样品产生<10 CT也是不可靠的，从进一步的分析排除。有几种方法，来分析我们的检测的qPCR数据和内部控制纳入有助于控制样本输入的变化。预MIR阵列包括一个U6对照引物，这往往是用来作为参考基因正常化从不同样品的CT值。这被称为三角洲CT值（DCT）的标准化值。结果往往是绘制为原料的CT，DCT值或标准值可进一步分析。

在图1中的全部四个不同的样品从timecourse实验前的microRNA阵列分析热图格式。每个前的小分子RNA的相对表达显示，并出现了三大鲜明的集群。大多数的分析预大鹏进行了小的，微不足道的变化，如预期（图1A）。然而，前的小分子RNA的一小部分有显着下降（图1B）或整个timecourse实验的急剧增加（图1C）。 0H时间点（样品1）作为基线水平的每一个预选的microRNA的表达水平正常化。在某些情况下，您可能会注意到，一些聚集前的microRNA也集中在热图分析（例如：让7A，图1B）。根据实验，集群可能出现依赖于病毒感染的细胞类型前的小分子RNA或预大鹏的具体体现，是一个共同的分子信号转导通路调节。

我们也已经开发出包括前的小分子RNA检测已知病毒前- microRNA和卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）和EB病毒（EBV）的除人类预大鹏编码基因的数量。这些可以被用来作为积极或消极的控制，取决于细胞株和所使用的样本的病毒状态。在图2中，一式四份运行KSHV的阴性样品平均的CT所示。重要的是，KSHV的LANA没有检测到在此示例中高度敏感的qPCR阵列。然而，U6 - 我国企业内部控制和let - 7A - 一个高度表达的人类前小分子RNA，表示检测不到的水平。最后，正如所料，PCR级水阴性对照没有产生的qPCR产品。

一个成功的qPCR运行的另一个指标是一个很好的的熔解曲线分析，可以洞察到样品中的潜在污染。要建立一个熔化温度，缓慢加热后的PCR完成板。由于DNA链分开，SYBR GREEN被释放，并降低荧光信号。温度在这个博士OP发生作图，作为样品的熔融温度。根据DNA序列，样品融化在彼此和水阴性对照，不应该有一个熔化温度，因为没有DNA存在不同的温度。从每对引物的PCR产物，应该在类似的温度融化。例如，图3显示了两个不同的引物重复使用同一样品的熔解曲线分析。很明显的熔化温度不同，但两个引物对样本是在完全相同的温度融化为每个复制。坏或可能受到污染的样品的迹象，可能包括几个熔融峰，表明存在两个不同的输入源。

出现图1。前的microRNA签名通过使用一种新型的qPCR基于阵列分析。平均deltaCTU6计算ArrayMinerTM软件装入标准值，高产heatmaps显示3个不同的集群。 （一）前的microRNA表达的小变化显示。前小分子RNA，其水平显着下降（B）或增加（三）也显示。蓝对应的表达水平较低，而红色代表表达水平增加。

图2：在qPCR的基于前的microRNA阵列的内部控制的共享。 3种不​​同的基因和无模板控制的原始CT值显示。 U6是用来作为内部阳性对照，PCR检测水作为我们的阴性对照服务。让- 7A - 1 - 1是通常在许多不同类型的细胞表达的microRNA，可以作为一个积极或消极的控制基于细胞系或组织使用的病毒状态，而KSHV的LANA。

图3。熔融峰前的小分子RNA引物和缺乏样品污染的分析。在LightCycler软件的使用TM调用分析熔解曲线获得。重复运行同一样品的两个不同的引物（底漆和B）所示。每个引物的熔融温度是不同的。然而，该样本只有一个高峰，展示了样品污染缺乏。

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讨论

QPCR是一个高度敏感的检测可以用来比较样本之间的基因表达水平，在一项研究中，以及在病毒的情况下，以确定阳性。使用的qPCR阵列的好处是每个样品许多引物（在我们的例子中，186对引物），在很短的时间内运行的能力。使用特餐自由EVO，设置可以进一步减少实验所需的时间，和机器人的准确性和一致性，如移液机器人，可以减少和消除移液错误。在这里，我们将演示如何使用特餐自由埃沃?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Freedom Evo 150	Tecan Group Ltd.	30017587
Matrix Electronic Multichannel Pipette	Thermo Fisher Scientific, Inc.	2001-MTX	(or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above)
Matrix Integrity Filter Tips, Sterile	Thermo Fisher Scientific, Inc.	7435	(or comparable tip for multichannel used)
Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master	Roche Group	04 707 516 001
Lightcycler 480 Instrument II	Roche Group	05015243001	384-well version
Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white	Roche Group	04729749001
LightCycler 480 Sealing Foil	Roche Group	04729757001
LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software	Roche Group	05075122001
Eliminase Decontaminant	Decon Laboratories	04-355-31