Arabidopsis thaliana التنميط Glycerolipid القطبية التي اللوني طبقة رقيقة (TLC) اقترن اللوني الغاز السائل (GLC)

Summary

ويتم تحديد تركيبة الدهون مقتطفات القطبية وتكوين الأحماض الدهنية glycerolipids الفردية في التجربة الدهون التنميط بسيطة وقوية. لهذا الغرض ، يتم عزل glycerolipids بواسطة طبقة رقيقة اللوني وتعرضوا لنقل الميثيل من مجموعاتهم أسيل. وكميا methylesters أسيل الدهنية بواسطة الغاز السائل اللوني.

Abstract

الأغشية البيولوجية خلايا منفصلة عن البيئة. من خلية واحدة للنباتات والحيوانات المتعددة الخلايا ، glycerolipids ، مثل فسفاتيديل كولين أو فسفاتيديل إيثانولامين ، والأغشية طبقة ثنائية الشكل الذي يكون بمثابة حدود كل من واجهات لتبادل الكيميائية بين الخلايا ومحيطها. على عكس الحيوانات والخلايا النباتية لديها عضية خاص لعملية التمثيل الضوئي ، وبلاستيدات الخضراء. منظومة معقدة من الأغشية تحتوي على بلاستيدات الخضراء glycerolipids فريدة من نوعها ، وهي تفتقر إلى الفوسفور glycolipids : monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) ، digalactosyldiacylglycerol (DGDG) ، sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) ^4. أدوار هذه الدهون هي خارج الهيكلية ببساطة. تم العثور على هذه glycolipids glycerolipids والأخرى في هياكل الكريستال الضوئي الأول والثاني مما يدل على تورط في عملية التمثيل الضوئي glycerolipids ^8،11. أثناء المجاعة الفوسفات ويتم نقل DGDG لأغشية extraplastidic لتعويض خسارة ^9،12 الفوسفاتية.

استمدت الكثير من معرفتنا الحيوي وظيفة هذه الدهون من مجموعة من الدراسات الجينية والبيوكيميائية مع ¹⁴ thaliana Arabidopsis. خلال هذه الدراسات ، تم إجراء بسيط لتحليل الدهون القطبية الأساسية لفحص وتحليل الدهون والمسوخ وسوف المبينة في التفاصيل. هي أول مرة فصل واستخلاص الدهون ورقة اللوني بواسطة طبقة رقيقة (TLC) والملون glycerolipids عكسية مع بخار اليود. يتم كشط الدهون فردية من لوحة TLC وتحويلها إلى methylesters أسيل الدهنية (جوع) ، والتي يتم تحليلها بواسطة الغاز السائل اللوني مقرونا كشف تأين اللهب (FID - GLC) (الشكل 1). وقد ثبت هذا الأسلوب ليكون أداة موثوقة لفحص متحولة. على سبيل المثال ، tgd1 ، 2،3،4 الشبكة الهيولية الباطنة إلى صانعة اكتشفت المسوخ الاتجار الدهون استنادا إلى تراكم غير طبيعي للgalactoglycerolipid : trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) وانخفاض في كمية النسبية ل18:03 (الكربونات : مزدوجة السندات) مجموعات أسيل الدهنية في الدهون غشاء ^{3،13،18،20.} هذا الأسلوب ينطبق أيضا لتحديد الأنشطة الأنزيمية للبروتينات باستخدام الدهون والركيزة ^6.

Protocol

1. استخراج الدهن

1. بدء استخراج الدهون عن طريق حصاد 30 ملغ Arabidopsis يترك لمدة 4 أسابيع من عمره من النباتات التي تزرع على أجار طدت المتوسطة أو التربة ونقلها إلى 1.5 مل رد فعل أنابيب البولي بروبلين. يمكن أن تكون الأوراق الطازجة فلاش المجمدة في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية.
2. إضافة 300 ميكرولتر استخراج المذيبات تتألف من الميثانول ، والكلوروفورم وحمض الفورميك (20:10:01 ، ت / V / V) لكل عينة. هزة بقوة (باستخدام الطلاء شاكر أو ما شابه) لمدة 5 دقائق.
3. إضافة 150 ميكرولتر من حامض الفوسفوريك 0.2 M (H ₃ PO ₄₎ (1) ، كلوريد البوتاسيوم M (بوكل) لفترة وجيزة الدوامة.
4. الطرد المركزي في 13000 XG في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة. وسيتم رصد الدهون الذائبة في مرحلة انخفاض كلوروفورم على لوحات TLC.

2. طبقة رقيقة اللوني (TLC) ¹⁵

1. لإعداد لوحات TLC ، يغرق هلام السيليكا 20cmx20cm المغلفة لوحة TLC مع تحميل الشريط لمدة 30 ثانية الى 0.15 م كبريتات الامونيوم ((NH _{4) 2} SO ₄₎ حل ، وبعد غمر لمدة 30 ثوان ، والجافة لوحة لا يقل عن 2 في أيام وعاء مغطى. أثناء التنشيط والتسامي الامونيوم يترك وراءه حامض الكبريتيك ، والتي protonates phosphatidylglycerol اللازمة لانفصالها عن glycerolipids الأخرى.
2. في يوم من التجربة ، وتفعيل لوحات TLC التي الخبز في الفرن على 120 درجة مئوية لمدة 2.5 ساعة.
3. بعد تهدئة لوحات تفعيلها إلى درجة حرارة الغرفة ، استخدم قلم الرصاص لرسم خط مستقيم (1.5 سم من حافة صفيحة) عبر لوحة في أصل chromatogram.
4. في غطاء الدخان ، وتقديم ببطء 3 X 20 ميكرولتر من استخراج الدهن في مرحلة انخفاض كلوروفورم باستخدام ماصة 20 ميكرولتر مع 200 نصائح ميكرولتر بلاستيكية صفراء تحت دفق بطء N _2. لهذا الغرض ، يتم توصيل الأنابيب لTygon المنظم للصهريج ₂ N. الحفاظ على بقعة أصغر من 1 سم في القطر. كل لوحة يمكن أن تعقد ما يصل الى 10 عينات (عندما يتم التخطيط لاحقة GLC التحليل).
5. كما دهن البقع الجافة تماما في غطاء الدخان ، وإعداد المذيب النامية تتكون من الأسيتون ، التولوين ، والمياه (91 مل : 30 مل : 7.5 مل). إذا كان المحيطة الرطوبة النسبية للهواء عالية ، يمكن أن تتأثر الانفصال. وينبغي في هذه الحالة يتم تخفيض المياه لإعطاء (91 مل : 30 مل : 7.0 مل) من أجل تحقيق الانفصال المنشود.
6. صب 80 مل من المذيب النامية الى اغلاقها باحكام TLC النامية الغرفة (L : H : W = 27.0 : 26.5 : 7.0 سم / سم / سم) ووضع لوحة في الصهريج مع نهاية عينة أسفل. ختم الدبابة باستخدام المشبك. وسوف يصعد المذيب لوحة وسيتم فصل الدهون. والوقت اللازم لتطوير ما يقرب من 50 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
7. عندما وصلت جبهة المذيب 1 سم من أعلى لوحة ، لوحة إزالة بعناية من الدبابة والجافة تماما في غطاء الدخان لمدة 10 دقائق تقريبا.
8. الدهون يمكن أن تكون مفصولة TLC إما ملطخة عكسية لفترة وجيزة مع اليود للتحليل الكمي أو ملطخة بشكل لا رجعة فيه مع حامض الكبريتيك أو α نفثول.
   1. حمض الكبريتيك تفحيم : رش لوحة مع حامض الكبريتيك 50 ٪ في الماء في زجاجة رذاذ في غطاء الدخان وأخبز في 120 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة (الشكل 2A).
   2. α - نفثول تلطيخ لglycolipids : رش لوحة مع 2.4 ٪ (W / V) α - نفثول في 10 ٪ (V / V) وحامض الكبريتيك ، و 80 ٪ (V / V) الايثانول وأخبز في 120 درجة مئوية لمدة 3-5 هي ملطخة دقائق حتى العصابات شحمي سكري الوردي أو الأرجواني (الشكل 2B). وسوف يؤدي إلى Overtreatment تفحم جميع الدهون بسبب وجود حامض الكبريتيك في الكاشف.
   3. تلطيخ اليود : في غطاء الدخان ، وضع لوحة في خزان TLC مغلقة مع بلورات اليود (في درج في القاع مما يؤدي إلى تشبع الجو مع بخار اليود حتى الدهون مرئية). لا تعرض لوحة على اليود واليود وقتا طويلا قد تعدل تساهميا الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة (الشكل 2C). بدلا من ذلك ، لتجنب أي أكسدة الدهون ، ينبغي ملطخة الممرات القياسية فقط تتخللها ممرات عينة باستخدام الصوف الزجاجي توصيل ماصة باستور مع بلورات اليود التي يتم من خلالها تفجير N ₂ على الطرق القياسية الفردية.

3. الأسيل Methylester الدهنية (فيم) الرد ¹⁶

1. إزالة بقع الدهون المحيطة السيليكا التي تم تحديدها من لوحة TLC بشفرة حلاقة. كشط الدهون التي تحتوي على السيليكا ونقل مسحوق السليكا باستخدام القمع في أنبوب زجاجي مع سقف المسمار التفلون (PTFE) مبطنة.
2. إضافة 1 مل 1 N حمض الهيدروكلوريك (HCL) في الميثانول اللامائية لكل عينة من ماصة الزجاج.
3. إضافة 100 مل ميكرولتر 50 ميكروغرام حامض pentadecanoic ^-1 (15:00) باستخدام 200 ميكرولتر ماصة لكل عينة وفقا لمعايير داخلية باستخدام ماصة 200 ميكرولتر مع 200 ميكرولتر الحافة البلاستيكية الصفراء. الحفاظ على أنبوب مع حمض الهيدروكلوريك في pentadecenoic فقط methanolic كمجموعة تحكم. إغلاق أنابيب زجاجية بشكل وثيق مع تفلون مبطنة مباراة دولية.
4. احتضان GLأنابيب الحمار في 80 ° C حمام الماء لمدة 25 دقيقة. أنابيب ضرورة أن تكون مختومة بحيث لا تتبخر المذيبات.
5. بعد أنابيب وتبريده ، إضافة 1 مل من كلوريد الصوديوم 0.9 ٪ تليها الهكسين مل 1 و دوامة بقوة. أجهزة الطرد المركزي في عينات 1000xg لمدة 3 دقائق.
6. في غطاء الدخان ، وإزالة طبقة الهكسان / العلوي من العينة مع ماصة باستير ووضعه في أنبوب زجاجي 13x100 جديدة ملم.
7. الهكسين تتبخر تحت دفق بطيء من دون تجفيف N ₂ تماما.
8. حل الدهنية الناتجة الأسيل methylesters ليالي في 60 ميكرولتر الهكسين. نقل العينات في قوارير الاوتوماتيكى وغطاء بإحكام. ويمكن تخزين العينات في 4 درجات مئوية على المدى القصير و -20 درجة مئوية لبضعة أيام.

4. الغاز السائل اللوني (GLC) ¹⁰

1. قبل بداية GLC ، وضمان أن يتم ملء الهيليوم والهيدروجين واسطوانات الهواء.
2. يجب أن يضاف الهكسين كافية لخزان المذيبات وحاوية النفايات يجب أن يكون فارغا. لفصل الدهنية methylesters الأسيل ، أرفق DB - 23 عمود إلى الجهاز.
3. قارورة مكان في الاوتوماتيكى. بدء تشغيل البرنامج لChemstation GLC على نظام الكمبيوتر.
4. ضبط درجة الحرارة عند مدخل 250 درجة مئوية مع معدل تدفق الهليوم عند 48.6 مل ^-1 دقيقة والضغط على 21.93 رطل. نسبة الانقسام هو 30،0 : 1.
5. يتم تعيين درجة حرارة الفرن في البداية على 140 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ورفعت الى 160 درجة مئوية بمعدل 25 دقيقة درجة مئوية ^-1. ثم تعيين لزيادة درجة الحرارة من 160 درجة مئوية إلى 250 درجة مئوية بمعدل 8 درجات مئوية ^-1 دقيقة وعقد في 250 درجة مئوية لمدة 4 دقائق تليها تنخفض إلى 140 درجة مئوية في معدل 38 درجة مئوية دقيقة ^{-- 1.} تشغيل واحدة يستغرق حوالي 21 دقيقة.
6. درجة حرارة اللهب كاشف التأين هو 270 درجة مئوية مع معدل تدفق الهيدروجين ^-1 30.0 دقيقة مل ، معدل تدفق الهواء في 400 مليلتر ^-1 دقيقة والهليوم معدل التدفق في 30.0 دقيقة ^-1 مل.
7. أدخل عدد من قوارير وأسماء عينة في تشغيل جدول التسلسل. تعيين 10 ميكرولتر حاقن لحقن عينة 2 ميكرولتر في القارورة.
8. عندما صك جاهز ، والشروع في تسلسل التشغيل.

5. ممثل النتائج :

وترد أمثلة على تلطيخ لا رجعة فيه TLC فصل الدهون من الشتلات Arabidopsis 4 أسابيع من العمر في الشكل 2. ومتفحمة في نسبة الدهون في حامض الكبريتيك الملون (الشكل 2A) ، ويظهر على شكل بقع بنية اللون. ويفضل α - نفثول لصبغ glycolipids مثل MGDG ، DGDG ، الخ SQDG Glycolipids ملطخة α - نفثول تحمل اللون الوردي اللون الارجواني بينما الدهون القطبية الأخرى صمة الصفراء (الشكل 2B). وتلطيخ اليود هو عكسها ، ويعطي لونا أصفر الدهون التي سوف تختفي على مدى فترة زمنية قصيرة كما يتبخر اليود (الشكل 2C). يمكن ان تخضع لفترة وجيزة الدهون اليود الملون لتحليل الدهون غير ملوثين GLC على الرغم من هي الأفضل للحد من تحطيم الدهون.

إذا فعلت بنجاح ، سيتم احظ اشارات مميزة يمثلون مختلف الدهنية الأسيل methylester بعد GLC (الشكل 3). methylester أسيل الدهنية مع سلسلة أقصر الكربون والسندات أقل وأقصر وقت نقرا الاحتفاظ باستخدام DB - 23 عمود. الدهنية التنميط methylester أسيل هي أداة حساسة لتحديد تركيبة الدهون المسوخ مع تغييرها. في الشكل 4 ، MGDG18 : هو انخفاض نسبة الأحماض الدهنية 3 الرحى في متحولة tgd4 - 1 مقارنة مع النوع البري ^18. بقسمة مولات methylester أسيل الدهنية الشحمية لفئة واحدة مع الشامات من جميع الطبقات الدهنية ، وتحسب نسبة المولي كل الدهون. على سبيل المثال ، لحساب نسبة ضرس MGDG :

(MGDG) مول ٪ = ٪ X100 Σ [جوع _(MGDG)] / Σ [جوع _(الكل)]

ويمكن مقارنة النسب الناتجة المولي من كل فئة من نوع الدهون على حد سواء البرية ومتحولة و. على سبيل المثال ، ازداد متحولة tgd4 - 1 المبالغ النسبية وMGDG PG ولكنها انخفضت كميات DGDG وPE (الشكل 5) ^18.

مخطط تدفق الرقم 1. تحليل الدهون القطبية باستخدام الشتلات Arabidopsis. يتم استخراج الدهون من مجموع الشتلات Arabidopsis 4 أسابيع من العمر ومفصولة TLC. ويمكن كشط الدهون فصلها عن لوحة لTLC الجزيئيات التبادلي تليها تحليل GLC.

الشكل 2. فصل الدهون على لوحات TLC. مقتطفات من الدهون 35 ملغ (الوزن الطازج) يتم فصل الفسائل نوع TLC والبرية التي اتسخت بسبب حامض الكبريتيك (A) ، α - نفثول (B) أو بخار اليود (C). وتظهر ثلاثة يكرر في كل أسلوب التلوين. DGDG ، digalactosyldiacylglycerol ؛ MGDG ، monogalactosyldiacylglycerol ؛ PC ، فسفاتيديل كولين ؛ PE ، فسفاتيديل إيثانولامين ؛ PG ، phosphatidylglyceرول ؛ PI ، فسفاتيديل إينوزيتول ؛ SQDG ، sulfoquinovosyldiacylglycerol.

الشكل 3. GLC Methylesters تحليل الأحماض الدهنية (جوع) المستمدة من MGDG من النوع البري. يتم فصل جوع على عمود 30 مترا الشعرية والكشف عنها بواسطة تأين اللهب. ويستخدم حمض Pentadecanoic (15:00) كمعيار داخلي.

الشكل 4. الأحماض الدهنية من نوع MGDG في البرية Col2 (الأعمدة البيضاء) وtgd4 - 1 متحولة (الأعمدة السوداء). وتعرض الأحماض الدهنية كما أن عدد ذرات الكربون يليها عدد من سندات مزدوجة. وبلغ متوسط ​​ثلاثة يكرر وتظهر الانحرافات المعيارية.

الشكل 5. القطبية الدهون تركيبة من النوع البري Col2 (الأعمدة البيضاء) وtgd4 - 1 متحولة (الأعمدة السوداء). وبلغ متوسط ​​ثلاثة يكرر وتظهر الانحرافات المعيارية بواسطة شريط الخطأ.

Discussion

TLC مقرونا GLC يوفر أداة قوية وسريعة للتحليل الكمي من الدهون القطبية في النباتات. يمكن التعرف على التغييرات الصغيرة في تكوين الدهون ، وبالتالي ، تم استخدام هذه الطريقة للكشف على نطاق واسع من المسوخ ضعف في المناطق القطبية المسارات الأيضية الشحمية ^1،20. كما تستخدم هذه الطريقة على نطاق واسع لرصد أنشطة الإنزيمات التي تستخدم الدهون القطبي هو الركيزة. ^2،6،7

بالإضافة إلى أوراق ، ويمكن أيضا تكوين الدهون في الأنسجة النباتية الأخرى مثل الجذور والبذور أو الكسور التحت خلوية مثل الميتوكوندريا والبلاستيدات الخضراء يتحدد في نفس الطريق.

تم تحسين نظام المذيب (الأسيتون ، التولوين ، والمياه) المستخدمة هنا لفصل glycolipids والدهون الفوسفاتية في النباتات. ومع ذلك ، في tgd1 المسوخ 2،3،4 ، والبلاستيدات الخضراء المعزولة ، TGDG يعمل جنبا إلى جنب مع المؤسسة العامة tetragalactosyldiacylglycerol بينما يعمل مع جهاز الكمبيوتر. في هذه الحالة مع نظام المذيب ، وكلوروفورم حمض الخليك الميثانول والماء (85 : 4 ، V / V / V / V 20 : 10) يتم استخدام ^13. أحيانا يتم تنفيذ ثنائي الأبعاد باستخدام TLC نظامين المذيبات المختلفة لفصل المزيد glycolipids والدهون الفوسفاتية ^19. بالإضافة ، يمكن الأنسجة النباتية تخضع مباشرة للتفاعل فيم تليها GLC لتحديد مجموع الأحماض الدهنية دون انفصال الأولي على TLC ^5. بجانب نظام TLC - GLC تظاهر ، يستند طريقة أخرى لاستخدام الدهون على التنميط المباشر electrospray التأين بالترادف الطيف الكتلي ^17. في هذا الأسلوب هو حذف الفصل الكروماتوغرافي الأولي من الدهون في استخراجها. ومع ذلك ، هذا الأسلوب يتطلب معدات مكلفة والموظفين ذوي الخبرة ، مما يجعله أقل فائدة للتحاليل روتينية في المختبر للفحص أو متحولة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
α-naphthol	Sigma-Aldrich	N1000
Methanolic HCL 3N	Sigma-Aldrich	33050-U	Dilute to 1N by methanol
Si250-PA TLC plates	JT Baker	7003-04	With pre-absorbent
TLC chamber	Sigma-Aldrich	Z266000
Screw cap tubes	VWR international	53283-800
Scew caps	Sun Sri	13-425
PTFE disk	Sun Sri	200 608
GLC system	Hewlett-Packard	HP6890
DB-23 column	J&W Scientific	122-2332
GLC vials	Sun Sri	500 132
Caps of GLC vials	Sun Sri	201 828
Chemstation software	Agilent Technologies	G2070AA