Arabidopsis thaliana Profiling Glycerolipid Polar por cromatografia em camada delgada (TLC) Juntamente com Cromatografia gás-líquido (GLC)

Resumo

Composição de extratos de lipídios polares e da composição de ácidos graxos de glycerolipids individuais são determinados em um experimento simples e robusto perfil lipídico. Para este fim, glycerolipids são isolados por cromatografia em camada delgada e submetido a transmetilação de seus grupos acil. Graxos methylesters acila são quantificados por cromatografia gás-líquido.

Resumo

Biológica células membranas separado do ambiente. A partir de uma única célula de plantas e animais multicelulares, glycerolipids, como fosfatidilcolina ou fosfatidiletanolamina, membranas formam bicamada que atuam tanto como os limites e interfaces para permuta química entre as células e seus arredores. Ao contrário dos animais, células vegetais têm uma organela especial para a fotossíntese, o cloroplasto. O sistema de membrana intrincados do cloroplasto contém glycerolipids única, ou seja, glicolipídeos falta de fósforo: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) ^4. Os papéis destes lipídios são além de simplesmente estrutural. Estes glicolipídeos e glycerolipids outros foram encontrados na estrutura cristalina do fotossistema I e II, que indica o envolvimento de glycerolipids na fotossíntese ^8,11. Durante a fome de fosfato, DGDG é transferido para membranas extraplastidic para compensar a perda de fosfolipídeos ^9,12.

Muito do nosso conhecimento da biossíntese e função desses lipídios foi derivado de uma combinação de estudos genéticos e bioquímicos com ¹⁴ Arabidopsis thaliana. Durante esses estudos, um procedimento simples para a análise de lipídios polares tem sido essencial para o rastreamento e análise de mutantes lipídico e será descrito em detalhes. Um extrato de lipídios folha é primeiro separados por cromatografia em camada delgada (TLC) e glycerolipids estão manchadas reversivelmente com vapor de iodo. Os lipídios individuais são raspadas da placa de TLC e convertidos em gordura methylesters acila (FAMEs), que são analisados ​​por cromatografia gás-líquido acoplado com detecção de ionização de chama (FID-GLC) (Figura 1). Este método tem provado ser uma ferramenta confiável para a seleção de mutantes. Por exemplo, o tgd1, 2,3,4 retículo endoplasmático-to-plastid mutantes tráfico de lipídios foram descobertos com base na acumulação de um galactoglycerolipid anormal: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) e uma diminuição na quantidade relativa de 18:03 (carbonos: double títulos) grupos acila graxos em lipídios de membrana ^3,13,18,20. Este método também é aplicável para a determinação atividades enzimáticas de proteínas usando lipídios como substrato ^6.

Protocolo

1. Extração de lipídeos

1. Começar a extração de lipídios colhendo 30 mg deixa quatro semanas de idade Arabidopsis partir de plantas cultivadas em ágar solidificado médio ou solo e transferi-los para 1,5 mL tubos de reacção de polipropileno. Folhas frescas podem ser flash congelado em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 ° C.
2. Adicionar 300 mL de extração de solvente composto por metanol, clorofórmio e ácido fórmico (20:10:01, v / v / v) para cada amostra. Agite vigorosamente (usando um misturador de tinta ou similar) por 5 minutos.
3. Adicionar 150 mL de ácido fosfórico 0,2 M (H ₃ PO _4), 1 M de cloreto de potássio (KCl) e brevemente vortex.
4. Centrifugar a 13.000 xg à temperatura ambiente por 1 minuto. Lipídios dissolvidos na fase de menor clorofórmio será manchado em placas de TLC.

2. Cromatografia em camada fina (TLC) ¹⁵

1. Para preparar as placas TLC, submerge um 20cmx20cm placa de sílica gel TLC revestido com carga strip por 30 segundos em 0,15 M de sulfato de amônio ((NH _{4) 2} SO ₄₎ solução, depois de submergir por 30 segundos, secar a placa por pelo menos dois dias no um recipiente coberto. Durante a ativação da sublimação de amônio deixa para trás ácido sulfúrico, que protonates fosfatidilglicerol necessário para a sua separação de glycerolipids outros.
2. No dia do experimento, ativar placas por TLC assando no forno a 120 ° C por 2,5 horas.
3. Após resfriamento das placas ativado à temperatura ambiente, use um lápis para desenhar uma linha reta (1,5 cm da borda da placa) em toda a placa na origem do cromatograma.
4. Em uma capela, lentamente entregar 3 X 20 mL do extrato lipídico na fase de menor clorofórmio, utilizando uma pipeta 20 mL com 200 mL amarelo dicas de plástico sob uma corrente lenta de N _2. Para esta finalidade, um tubo Tygon é conectado ao regulador do ₂ N tanque. Mantenha o ponto inferior a 1 cm de diâmetro. Cada placa pode conter até 10 amostras (quando a análise subseqüente é planejada GLC).
5. Como o de lipídios spots completamente seco na capela, prepare o solvente de desenvolvimento composto de acetona, tolueno, água (91 mL: 30 mL: 7,5 mL). Se a umidade relativa do ar ambiente é alta, a separação poderia ser afetada. Neste caso, a água deve ser reduzida para dar (mL 91: 30 mL: 7,0 mL) para conseguir a separação desejada.
6. Despeje 80 ml solvente de desenvolvimento em um TLC selável desenvolvimento câmara (L: H: W = 27,0: 26,5: 7,0, cm / cm / cm) e colocar a placa para dentro do tanque com o fim da amostra virada para baixo. Vedação do tanque usando a braçadeira. O solvente irá subir a placa e lipídios serão separados. O tempo de desenvolvimento é de aproximadamente 50 minutos em temperatura ambiente.
7. Quando a frente do solvente tenha atingido 1 cm do topo da placa, remova cuidadosamente a placa da tina e secar completamente na capela por aproximadamente 10 minutos.
8. Lipídios separados por TLC pode ser reversível manchada brevemente com iodo para a análise quantitativa ou irreversivelmente manchado com ácido sulfúrico ou α-naftol.
   1. Sulfúrico carbonização ácido: pulverizar a placa com 50% de ácido sulfúrico em água em um frasco spray de vidro no extractor de fumo e leve ao forno a 120 ° C por 15 minutos (Figura 2A).
   2. α-naftol coloração para glycolipids: pulverizar a placa com 2,4% (w / v) α-naftol em 10% (v / v) de ácido sulfúrico, 80% (v / v) etanol e leve ao forno a 120 ° C por 3-5 minutos, até bandas glicolipídeo estão manchadas rosa ou roxo (Figura 2B). Sobretratamento levará a carbonização de todos os lipídios devido à presença de ácido sulfúrico no reagente.
   3. Coloração de iodo: em um exaustor, colocar a placa em um tanque de TLC fechado com cristais de iodo (em uma bandeja na parte inferior levando à saturação da atmosfera com vapor de iodo até lipídios são visíveis). Não expor a placa ao iodo muito tempo como o iodo pode modificar covalentemente de ácidos graxos poliinsaturados (Figura 2C). Como alternativa, para evitar a oxidação de lipídios, apenas pistas padrão intercaladas com faixas de amostra deve ser manchado com um a lã de vidro conectado Pasteur pipeta com cristais de iodo através do qual N ₂ é soprado sobre pistas individuais padrão.

3. Acil graxos metílicos Reaction (FAME) ¹⁶

1. Remove manchas de sílica em torno de lipídios identificados a partir da placa de TLC com uma lâmina de barbear. Raspe a sílica contendo lipídios e transferir o pó de sílica utilizando um funil para um tubo de vidro com tampa de rosca de teflon (PTFE) alinhadas.
2. Adicionar 1 mL de ácido clorídrico 1 N (HCl) em metanol anidro para cada amostra de vidro pipeta.
3. Adicionar 100 mL 50 mg mL ^-1 pentadecanoic ácido (15:00), utilizando 200 mL de pipeta para cada amostra como padrão interno, utilizando uma pipeta 200 mL com 200 mL ponta de plástico amarela. Mantenha um tubo com apenas ácido pentadecenoic em metanólico HCl como controle. Fechar os tubos de vidro firmemente com Teflon alinhadas caps.
4. Incubar glass tubos em um banho de água 80 ° C por 25 minutos. Tubos devem ser selados de forma que o solvente não evapore.
5. Depois de tubos têm arrefecido, adicione 1 mL de cloreto de sódio a 0,9%, seguido por uma hexano mL e vortex vigorosamente. Centrifugar amostras 1000xg por 3 minutos.
6. Na capela, remova a camada de hexano / superior da amostra com uma pipeta Pasteur e colocá-lo em um novo tubo de vidro 13x100 milímetros.
7. Evaporar hexano sob uma corrente lenta de N ₂ sem secar completamente.
8. Dissolver o resultado graxos acil methylesters s em 60 mL de hexano. Transferência de amostras em frascos de amostrador automático e tampa. Amostras podem ser armazenadas a 4 ° C para curto prazo e -20 ° C por alguns dias.

4. Cromatografia gás-líquido (GLC) ¹⁰

1. Antes de iniciar GLC, Certifique-se que o hidrogênio, hélio e cilindros de ar são preenchidos.
2. Hexano suficiente deve ser adicionado ao reservatório de solvente e o recipiente de resíduos deve estar vazio. Para graxos separação methylesters acila, anexar um DB-23 da coluna para a máquina.
3. Frascos lugar para o amostrador automático. Inicie o software ChemStation para GLC no computador do sistema.
4. Definir a temperatura de entrada a 250 ° C com taxa de fluxo de hélio em 48,6 mL min ^-1 ea pressão em 21,93 psi. A razão de separação é de 30,0: 1.
5. A temperatura do forno é definido inicialmente a 140 ° C por 2 min e aumentada para 160 ° C a uma taxa de 25 ° C min ^-1. Em seguida, defina a temperatura aumente de 160 ° C a 250 ° C a uma taxa de 8 ° C min ^-1 e mantenha a 250 ° C por 4 min seguido por uma diminuição para 140 ° C a uma taxa de 38 ° C min ^{- 1.} Uma corrida dura aproximadamente 21 minutos.
6. A temperatura do detector de ionização de chama é de 270 ° C com uma taxa de fluxo de hidrogênio de 30,0 mL min ^-1, vazão de ar de 400 mL min ^-1 e taxa de fluxo de hélio em 30,0 mL min ^-1.
7. Digite o número de frascos e nomes de amostra na tabela de seqüência de execução. Definir o injector de 10 L para injetar 2 mL da amostra por frasco.
8. Quando o instrumento está pronto, iniciar a seqüência de execução.

5. Resultados representativos:

Exemplos de coloração irreversível de TLC-separados lipídios a partir de mudas de quatro semanas de idade Arabidopsis são mostrados na Figura 2. Os lipídios ácido sulfúrico corado (Figura 2A) estão carbonizados e aparecem como manchas marrons. α-naftol é preferível a mancha glycolipids como MGDG, DGDG, SQDG etc Glicolipídeos corados com α-naftol levar uma cor rosa-púrpura, enquanto outros lipídeos polares mancha amarela (Figura 2B). A coloração de iodo é reversível e dá lipídios uma cor amarelada que desaparecerão ao longo de um curto período de tempo como evapora iodo (Figura 2C). Lipídios brevemente iodo manchadas podem ser submetidos à análise GLC embora imaculada lipídios são preferíveis para reduzir a quebra de lipídios.

Se feito com sucesso, os sinais distintivos que representam diferentes Fatty acil metílicos será observado após GLC (Figura 3). Metílicos de acila graxos de cadeia curta de carbono e menos ligações duplas têm menor tempo de retenção usando o DB-23 coluna. Graxos acil perfil metílico é um instrumento sensível para identificar mutantes com composição lipídica alterada. Na Figura 4, o MGDG18: 3 proporção molar de ácidos graxos é reduzida no mutante tgd4-1 em relação ao tipo selvagem ^18. Dividindo-se o moles de gordos acil metílicos para uma classe de lipídios com as toupeiras de todas as classes de lipídios, a relação molar de cada lipídios são calculados. Por exemplo, para calcular a razão molar de MGDG:

(MGDG) mol% =% x100 Σ [FAMEs _(MGDG)] / Σ [FAMEs _(total)]

As relações resultantes molar de cada classe de lipídeos de tanto o tipo selvagem eo mutante pode ser comparado. Por exemplo, o mutante tgd4-1 aumentou quantidades relativas de MGDG e PG, mas diminuiu quantidades de DGDG e PE (Figura 5) ^18.

Figura Fluxograma 1. Da análise de lipídios polar usando mudas de Arabidopsis. Lipídios totais são extraídos de mudas de quatro semanas de idade Arabidopsis e separados por TLC. Os lipídios podem ser separados raspadas TLC placa de transesterificação seguido de análise GLC.

Figura 2. Separação de lipídios em placas de TLC. Extratos de lipídios de 35 mg (peso fresco) de mudas do tipo selvagem são separados por TLC e corados pelo ácido sulfúrico (A), α-naftol (B) ou iodo vapor (C). Três repetições são mostradas em cada método de coloração. DGDG, digalactosyldiacylglycerol; monogalactosyldiacylglycerol MGDG,; PC, fosfatidilcolina, PE, fosfatidiletanolamina, PG, phosphatidylglycerol; PI, fosfatidilinositol; SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol.

Figura 3. GLC análise de Methylesters ácidos graxos (FAMEs) derivado de MGDG do tipo selvagem. FAMEs são separados em uma coluna de 30 m capilar e detectado por ionização de chama. Pentadecanoic ácido (15:00) é usado como padrão interno.

Figura 4. Perfil de ácidos graxos de MGDG no tipo selvagem Col2 (colunas brancas) e os tgd4-1 mutante (colunas pretas). Ácidos graxos são apresentados como o número de carbonos, seguido do número de ligações duplas. Três repetições são em média e desvios-padrão são mostrados.

Figura 5. Composição de lipídios polares do tipo selvagem Col2 (colunas brancas) e os tgd4-1 mutante (colunas pretas). Três repetições são em média e desvios-padrão são mostrados pela barra de erro.

Discussão

TLC juntamente com GLC fornece uma ferramenta robusta e rápida de análise quantitativa de lipídios polares em plantas. Pequenas mudanças na composição lipídica podem ser identificados e, portanto, este método tem sido utilizado para triagem em larga escala de mutantes deficientes nas vias metabólicas lipídicas polar ^1,20. Este método também é amplamente utilizado para atividades de monitoramento de enzimas utilizando lipídeos polares como substrato. ^2,6,7

Além de folhas, a composição lipídica de outros tecidos vegetais, como raízes e sementes ou frações subcelulares, como cloroplastos e mitocôndria também pode ser determinado da mesma maneira.

O sistema de solvente (acetona, tolueno, água) aqui utilizado é otimizado para a separação de glicolipídios e fosfolipídios em plantas. No entanto, em tgd1, 2,3,4 mutantes e cloroplastos isolados, TGDG executado em conjunto com o PE, enquanto tetragalactosyldiacylglycerol funciona com PC. Neste caso, um sistema de solventes com clorofórmio, metanol, ácido acético e água (85: 20: 10: 4, v / v / v / v) é usado ^13. Às vezes bidimensional TLC usando dois diferentes sistemas solventes é realizada para mais glycolipids separado e fosfolipídios ^19. Além disso, tecidos vegetais podem ser diretamente submetidas à reação FAME seguido por GLC para determinar o perfil de ácidos graxos totais, sem separação inicial sobre TLC ^5. Ao lado do TLC-GLC demonstrado sistema, outro método utilizado para o perfil lipídico é baseado em directo de massas com ionização electrospray em tandem espectrometria de ^17. Neste método, a separação cromatográfica inicial de lipídios no extrato é omitido. No entanto, este método requer equipamentos caros e pessoal experiente, o que o torna menos útil para análises de rotina no laboratório ou para a seleção de mutantes.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
α-naphthol	Sigma-Aldrich	N1000
Methanolic HCL 3N	Sigma-Aldrich	33050-U	Dilute to 1N by methanol
Si250-PA TLC plates	JT Baker	7003-04	With pre-absorbent
TLC chamber	Sigma-Aldrich	Z266000
Screw cap tubes	VWR international	53283-800
Scew caps	Sun Sri	13-425
PTFE disk	Sun Sri	200 608
GLC system	Hewlett-Packard	HP6890
DB-23 column	J&W Scientific	122-2332
GLC vials	Sun Sri	500 132
Caps of GLC vials	Sun Sri	201 828
Chemstation software	Agilent Technologies	G2070AA