Arabidopsis thaliana Полярный профилирования Glycerolipid по Тонкослойная хроматография (ТСХ) в сочетании с газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ)

Резюме

Состав экстрактов полярных липидов и жирных кислот отдельных глицеролипидов определяются в простой и надежной эксперимент профилирования липидов. Для этой цели глицеролипидов изолированы с помощью тонкослойной хроматографии и подвергается трансметилирования их ацильных групп. Жирные ацил methylesters количественно с помощью газо-жидкостной хроматографии.

Аннотация

Биологические мембраны отдельные клетки от окружающей среды. Из одной клетки до многоклеточных растений и животных, глицеролипидов, такие как фосфатидилхолин или фосфатидилэтаноламина, форма бислоя мембран, которые действуют как обе границы и интерфейсы для химического обмена между клетками и окружающей средой. В отличие от животных, растительные клетки имеют специальные органеллы для фотосинтеза, хлоропласта. Сложная система мембран хлоропласта содержит уникальные глицеролипидов, а именно гликолипиды не хватает фосфора: monogalactosyldiacylglycerol (МГДГ), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) ^4. Роль этих липидов не просто структурный. Эти и другие гликолипиды глицеролипидов были найдены в кристаллических структурах фотосистемы I и II с указанием участия в фотосинтезе глицеролипидов ^8,11. Во время голодания фосфат, DGDG передается extraplastidic мембраны, чтобы компенсировать потери фосфолипиды ^9,12.

Большая часть наших знаний о биосинтез и функции этих липидов, была получена из сочетания генетических и биохимических исследований с Arabidopsis thaliana ^14. В ходе этих исследований, простая процедура анализа полярных липидов имеет огромное значение для отбора и анализа липидных мутантов и будут изложены в деталях. Экстракт листьев липидов первых, разделенных тонкослойной хроматографии (ТСХ) и глицеролипидов окрашиваются обратимо с парами йода. Отдельных липидов Царапины от пластины ТСХ и преобразуется в жирные ацильные methylesters (FAMEs), которые анализируются с помощью газо-жидкостной хроматографии в сочетании с пламенно-ионизационным обнаружения (ФИД-GLC) (рис. 1). Этот метод был доказан, чтобы быть надежным инструментом для скрининга мутантов. Например, tgd1, 2,3,4 эндоплазматической сети к пластид мутантов торговли липидного были обнаружены на основе накопления ненормальных galactoglycerolipid: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) и уменьшение относительного количества 18:3 (углероды: двуспальная облигаций), жирных ацильных групп в мембранных липидов ^3,13,18,20. Этот метод также применяется для определения ферментативной активности белков использованием липидов в качестве субстрата ^6.

протокол

1. Экстракции липидов

1. Начните экстракции липидов, собирая по 30 мг 4-недельных Arabidopsis листья с растений, выращенных на агаре затвердевших средний или почвы и передача их в 1,5 мл полипропиленовые трубы реакции. Свежие листья могут быть заморозки в жидком азоте и хранили при -80 ° C.
2. Добавить 300 мкл экстракционный растворитель в составе метанол, хлороформ и муравьиную кислоту (20:10:01, об / об / об) для каждого образца. Встряхивать (с использованием краски шейкер или аналогичный) в течение 5 минут.
3. Добавить 150 мкл 0,2 М фосфорной кислоты (H ₃ PO _4), 1 М хлористого калия (KCl) и вихревые кратко.
4. Центрифуга при 13000 мкг при комнатной температуре в течение 1 минуты. Липиды растворяются в нижней фазе хлороформ, должен быть выставлен на пластины ТСХ.

2. Тонкослойной хроматографии (ТСХ) ¹⁵

1. Для подготовки ТСХ пластин, погрузиться 20cmx20cm силикагель покрытием ТСХ пластины с загрузкой полосы на 30 секунд в 0,15 М сульфата аммония ((NH _{4) 2} SO ₄₎ решение, после погружения в течение 30 секунд, сухая пластина, по крайней мере за 2 дня закрытый контейнер. Во время активации сублимации аммония оставляет серной кислоты, которая protonates фосфатидилглицерина, необходимых для его отделения от других глицеролипидов.
2. В день эксперимента, активировать ТСХ пластин выпечки в духовке при температуре 120 ° С в течение 2,5 часов.
3. После охлаждения активированного пластин до комнатной температуры, используйте карандаш, чтобы нарисовать прямую линию (1,5 см от края пластины) через пластину в начале хроматограммы.
4. В вытяжном шкафу, не спеша доставить 3 X 20 мкл липидного экстракта в нижней фазе с использованием хлороформа 20 мкл пипетки 200 мкл желтый пластиковыми наконечниками под медленный поток N _2. Для этой цели Tygon трубы соединен с регулятором N ₂ бака. Держите место менее 1 см в диаметре. Каждая пластина может хранить до 10 образцов (при последующем анализе КЗС планируется).
5. Как липидные пятна полностью высохнуть в вытяжном шкафу, подготовить проявляющего растворителя в составе ацетон, толуол, вода (91 мл: 30 мл: 7,5 мл). Если температура окружающего относительная влажность воздуха высокая, разделения могут быть затронуты. В этом случае вода должна быть снижена, чтобы дать (91 мл: 30 мл: 7,0 мл) для достижения желаемого разделения.
6. Налейте 80 мл растворителя в развивающихся герметичные TLC развивающихся камерой (L: H: W = 27,0: 26,5: 7,0, см / см / см) и поместите пластину в емкость с образцом конца вниз. Печать бак использованием зажима. Растворитель поднимется плита и липидов будут разделены. Развитие в течение примерно 50 минут при комнатной температуре.
7. Когда фронта растворителя достигла 1 см от верхней части плиты, осторожно удалить пластину из бака и полностью высохнуть в вытяжном шкафу в течение примерно 10 минут.
8. Липиды, разделенных TLC может быть обратимо окрашенных кратко йодом для количественного анализа или необратимо окрашивали серной кислоты или α-нафтола.
   1. Серная кислота обугливания: спрей пластину с 50%-ной серной кислоты в воде в стеклянной бутылке брызги в вытяжной шкаф и выпекать при температуре 120 ° С в течение 15 минут (рис. 2А).
   2. α-нафтола окрашивание на гликолипиды: спрей пластины с 2,4% (м / о) α-нафтола в 10% (об. / об), серной кислоты, 80% (объем / объем) этанола и выпекать при температуре 120 ° С в течение 3-5 минут, пока гликолипид окрашенных полос розового или фиолетового (рис. 2В). Избыточного лечения приведет к обугливание всех липидов, из-за присутствия серной кислоты в реагента.
   3. Йод окрашиванию: в вытяжной шкаф, место пластину в закрытой цистерны TLC с кристаллами йода (в лоток в нижней ведет к насыщению атмосферы с парами йода, пока липидов видны). Не подвергайте пластины на йод слишком долго, как йод ковалентно могут изменить полиненасыщенных жирных кислот (рис. 2С). Кроме того, чтобы избежать окисления липидов, только стандартные полосы чередуются с полосами образца должны быть окрашены использовании стекловаты подключен пипетку Пастера с кристаллами йода, через которую N ₂ продувается над отдельными стандартных полос.

3. Жирные ацил метиловый эфир (FAME) Реакция ¹⁶

1. Удалить кремнезема окружающих определены места липидного от пластины ТСХ с лезвия бритвы. Очистите липидного содержащих кремний и передачи кремнезема порошок, используя воронки в стеклянную трубку с тефлоновым (PTFE) картонных винтовой крышкой.
2. Добавьте 1 мл 1 N соляной кислоты (HCl) в безводном метаноле для каждого образца на стеклянной пипетки.
3. Добавить 100 мкл 50 мкг мл ^-1 pentadecanoic кислоты (15:00) с помощью пипетки 200 мкл каждого образца в качестве внутреннего стандарта использовании 200 мкл пипетки 200 мкл желтый наконечник пластика. Держите трубку только с pentadecenoic кислоты в метаноле HCl в качестве контроля. Закрыть стеклянные трубки, плотно с тефлоновым покрытием крышки.
4. Инкубируйте GLзадницу труб в 80 ° С на водяной бане 25 минут. Трубы должны быть герметизированы таким образом, что растворитель не испарится.
5. После трубы остыли, добавьте 1 мл 0,9% хлорида натрия, затем 1 мл гексана и вихревые энергично. Центрифуга образцов при 1000xg течение 3 минут.
6. В вытяжном шкафу, удалить гексан / верхний слой образца с пипетки Пастера и поместите его в новой трубы 13x100 мм стекло.
7. Evaporate гексана при медленном потоке N ₂ без сушки полностью.
8. Растворите в результате жирных ацильных methylesters с в 60 мкл гексана. Передача образцов в автосамплером флакона и крышки плотно. Образцы могут храниться при температуре 4 ° С на короткий срок и -20 ° С в течение нескольких дней.

4. Газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ) ¹⁰

1. Перед началом КЗС, убедитесь, что гелия, водорода и воздуха цилиндры заполнены.
2. Достаточное гексан должен быть добавлен в растворителе водохранилища и контейнер для отходов должны быть пустыми. Для жирных ацильных разделения methylesters, приложите DB-23 колонки к машине.
3. Место флаконов в автосамплером. Начало Chemstation программного обеспечения для КЗС по компьютерной системе.
4. Установите температуру на входе при 250 ° C с гелием расход, при 48,6 мл мин ^-1 и давление на 21,93 фунтов на квадратный дюйм. Коэффициент распределения составляет 30,0: 1.
5. Температуру в духовке установлен изначально при 140 ° С в течение 2 мин и вырос до 160 ° С со скоростью 25 ° С мин ^-1. Затем установить температуру, увеличится с 160 ° C до 250 ° С со скоростью 8 ° C мин ^-1 и держать при температуре 250 ° С в течение 4 мин, а затем снижением до 140 ° С со скоростью 38 ° С мин ^{- 1.} Один запуска занимает около 21 минут.
6. Температура детектора ионизации пламени составляет 270 ° С расход водорода в 30,0 мл мин ^-1, скорость потока воздуха при 400 мл мин ^-1 и гелия, расход, при 30,0 мл мин ^-1.
7. Введите количество флаконов и примеры имен в таблице последовательность запуска. Установить 10 мкл инжектор для введения 2 мкл образца на флакон.
8. Когда прибор будет готов, инициировать последовательность выполнения.

5. Представитель Результаты:

Примеры необратимых окрашивание TLC разделенных липидов из 4-недельного сеянцев Arabidopsis показаны на рисунке 2. Серной кислоты, липиды, витражи (рис. 2а) обугленные и появляются в виде коричневых пятен. α-нафтола предпочтительнее пятно гликолипиды, такие как МГДГ, DGDG, SQDG т.д. гликолипиды окрашивали α-нафтола носить розово-фиолетовый цвет, а другие полярные липиды пятно желтого (рис. 2В). Йод окрашивания является обратимым и дает липидов желтоватого цвета, которые исчезнут в течение короткого времени, как йод испаряется (рис. 2С). Кратко йода окрашенных липиды могут быть подвергнуты анализу КЗС хотя неокрашенных липидов предпочтительнее уменьшить сломать липидов.

Если все сделано успешно, отличительных сигналов, представляющих различные жирные ацильные метиловый эфир будет наблюдаться после GLC (рис. 3). Жирные ацил метиловый эфир с более короткой углеродной цепью и меньше двойных связей имеют более короткий срок хранения использованием DB-23 колонки. Жирные ацил метиловый профилирования является чувствительным инструментом для выявления мутантов с измененным составом липидов. На рисунке 4, MGDG18: 3 жирные кислоты молярное соотношение уменьшается в tgd4-1 мутантов по сравнению с диким типом ^18. Разделив молей жирных ацильных метиловый эфир для одного класса с липидной молей всех липидных классов, молярное отношение каждого липидного рассчитываются. Например, для расчета молярного отношения МГДГ:

(МГДГ) мол% = Σ [FAMEs _(МГДГ)] / Σ [FAMEs _{(всего)]} х100%

В результате молярные отношения каждого класса из липидных как дикого типа и мутанта можно сравнить. Например, tgd4-1 мутант увеличилось относительное количество МГДГ и PG, но уменьшилась количество DGDG и ПЭ (рис. 5) ^18.

Рисунок 1. Схема полярной анализ липидного использованием Arabidopsis саженцев. Всего липиды извлекаются из 4-недельного сеянцев Arabidopsis и разделенных TLC. Разделенных липиды могут быть Царапины от ТСХ пластины для переэтерификации с последующим анализом КЗС.

Рисунок 2. Разделение липидов на пластинах ТСХ. Липидный экстракт 35 мг (сырого веса) дикие сеянцы типа разделяются TLC и окрашивали серной кислоты (А), α-нафтола (В) или паров йода (С). Три повторяет показаны в каждом окрашивания методом. DGDG, digalactosyldiacylglycerol; МГДГ, monogalactosyldiacylglycerol; ПК, фосфатидилхолин, ПЭ, фосфатидилэтаноламина, PG, phosphatidylglyceРОЛ; П.И., фосфатидилинозитол; SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol.

Рисунок 3. GLC анализ жирных кислот Methylesters (FAMEs), полученных из МГДГ дикого типа. FAMEs разделены на 30 м капиллярной колонкой и детектируется ионизации пламени. Pentadecanoic кислоты (15:00) используют в качестве внутреннего стандарта.

Рисунок 4. Жирных кислот МГДГ в дикого типа Col2 (белые столбцы) и tgd4-1 мутант (черные столбцы). Жирные кислоты представлены как число атомов углерода следуют числа двойных связей. Три повторяет усредняются и стандартные отклонения показаны.

Рисунок 5. Полярный состав липидов дикого типа Col2 (белые столбцы) и tgd4-1 мутант (черные столбцы). Три повторяет усредняются и стандартные отклонения показаны ошибки бар.

Обсуждение

ТСХ в сочетании с КЗС обеспечивает надежный и быстрый инструмент для количественного анализа полярных липидов в растениях. Небольшие изменения в липидный состав могут быть идентифицированы, поэтому этот метод был использован для скрининга большого масштаба мутантов нарушениями липидного в полярных метаболических путей ^1,20. Этот метод также широко используется для мониторинга активности ферментов использованием полярных липидов в качестве субстрата. ^2,6,7

Кроме листьев, липидный состав других тканей растений, таких как корни и семена или субклеточных фракций, таких как хлоропластов и митохондрий также может быть определено таким же образом.

Растворитель (ацетон, толуол, вода), используемая здесь, оптимизированный для разделения гликолипидов и фосфолипидов в растениях. Однако в tgd1, 2,3,4 мутантов и изолированных хлоропластов, TGDG работает вместе с ПЭ в то время как tetragalactosyldiacylglycerol работает с ПК. В этом случае система растворителя хлороформа, метанола, уксусной кислоты и воды (85: 20: 10: 4, объем / объем / объем / объем) используется ^13. Иногда двумерной ТСХ с использованием двух различных системах растворителей производится дальнейшее разделение гликолипиды и фосфолипиды ^19. Кроме того, растительные ткани могут быть непосредственно подвергаются FAME реакции следуют КЗС для определения общего жирных кислот без первоначального разделения на TLC ^5. Кроме продемонстрировали TLC-GLC системой, другой метод, используемый для липидного профиля основан на прямом электрораспылением ионизации тандемной масс-спектрометрии ^17. В этом методе начальной хроматографического разделения липидов в экстракте опускается. Однако этот метод требует дорогостоящего оборудования и квалифицированного персонала, что делает его менее полезным для рутинных анализов в лаборатории или у мутантов скрининга.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
α-naphthol	Sigma-Aldrich	N1000
Methanolic HCL 3N	Sigma-Aldrich	33050-U	Dilute to 1N by methanol
Si250-PA TLC plates	JT Baker	7003-04	With pre-absorbent
TLC chamber	Sigma-Aldrich	Z266000
Screw cap tubes	VWR international	53283-800
Scew caps	Sun Sri	13-425
PTFE disk	Sun Sri	200 608
GLC system	Hewlett-Packard	HP6890
DB-23 column	J&W Scientific	122-2332
GLC vials	Sun Sri	500 132
Caps of GLC vials	Sun Sri	201 828
Chemstation software	Agilent Technologies	G2070AA