Perfiles de Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid por cromatografía en capa fina (TLC), junto con cromatografía de gases (GLC)

Resumen

Composición de los extractos de lípidos polares y la composición de ácidos grasos de glicerolípidos individuales están determinados en un experimento de lípidos perfil simple y robusto. Para ello, glicerolípidos están aislados por cromatografía en capa fina y se somete a transmetilación de sus grupos acilo. Grasos methylesters acilo son cuantificados por cromatografía de gases.

Resumen

Las células de las membranas biológicas separado del medio ambiente. De una sola célula de plantas y animales multicelulares, glicerolípidos, tales como la fosfatidilcolina o fosfatidiletanolamina, membranas forman dos capas que actúan como los límites y las interfaces para el intercambio químico entre las células y su entorno. A diferencia de los animales, las células vegetales tienen un orgánulo especial para la fotosíntesis, los cloroplastos. El sistema de membranas de los cloroplastos intrincada contiene glicerolípidos única, es decir, glicolípidos que carecen de fósforo: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) ^4. Las funciones de estos lípidos están más allá de simplemente estructural. Estos glicolípidos y glicerolípidos otros fueron encontrados en las estructuras cristalinas del fotosistema I y II que indica la participación de glicerolípidos en la fotosíntesis ^8,11. Durante la hambruna de fosfato, DGDG se transfirieron a membranas de extraplastidic para compensar la pérdida de los fosfolípidos de ^9,12.

Mucho de nuestro conocimiento de la biosíntesis y la función de estos lípidos se ha derivado de una combinación de estudios genéticos y bioquímicos con ¹⁴ Arabidopsis thaliana. Durante estos estudios, un procedimiento sencillo para el análisis de los lípidos polares ha sido esencial para la detección y el análisis de mutantes de lípidos y se describen en detalle. Un extracto lipídico de la hoja es primero separado por cromatografía en capa fina (TLC) y glicerolípidos se tiñen de forma reversible con vapor de yodo. Los lípidos son individuales raspado de la placa de TLC y se convierte en grasa methylesters acilo (FAME), que son analizados por cromatografía de gases acoplada con detección de ionización de llama (FID-GLC) (Figura 1). Este método ha demostrado ser una herramienta fiable para la detección de mutantes. Por ejemplo, el tgd1, 2,3,4 retículo endoplasmático a plastidio mutantes tráfico de lípidos fueron descubiertos sobre la base de la acumulación de una galactoglycerolipid anormal: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) y una disminución en la cantidad relativa de 18:3 (carbones: doble bonos) grupos acilo grasos en los lípidos de membrana ^3,13,18,20. Este método también es aplicable para la determinación de actividades enzimáticas de las proteínas con los lípidos como sustrato ^6.

Protocolo

1. La extracción de lípidos

1. Comenzar la extracción de lípidos de la cosecha de 30 mg de 4 semanas de edad, hojas de Arabidopsis a partir de plantas cultivadas en agar solidificado medio o en el suelo y transferirlas a tubos de 1,5 ml de la reacción de polipropileno. Las hojas frescas se puede flash congelado en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C.
2. Añadir 300 l de extracción de solventes compuesto por metanol, cloroformo y ácido fórmico (20:10:01, v / v / v) para cada muestra. Agitar vigorosamente (con un agitador de pintura o similar) durante 5 minutos.
3. Añadir 150 ml de ácido fosfórico 0,2 M (H ₃ PO _4), 1 M de cloruro de potasio (KCL) y agitar brevemente.
4. Se centrifuga a 13.000 xg a temperatura ambiente durante 1 minuto. Lípidos disueltos en la fase inferior de cloroformo se colocan sobre placas TLC.

2. Cromatografía en capa fina (TLC) ¹⁵

1. Para preparar las placas de TLC, se sumergen una placa de gel de sílice recubiertas 20cmx20cm TLC con la carga de la tira durante 30 segundos en 0,15 M de sulfato de amonio ((NH _{4) 2} SO ₄₎ solución, después de sumergir durante 30 segundos, secar la placa por lo menos 2 días un recipiente tapado. Durante la activación de la sublimación de amonio deja tras de ácido sulfúrico, que protona fosfatidilglicerol necesarios para su separación de glicerolípidos otros.
2. En el día de experimento, activar TLC placas de hornear en un horno a 120 ° C durante 2,5 horas.
3. Después del enfriamiento de las placas activa a temperatura ambiente, utilice un lápiz para dibujar una línea recta (1,5 cm del borde de la placa) a través de la placa en el origen del cromatograma.
4. En una campana extractora, lentamente entregar 3 x 20 l de extracto de lípidos en la fase inferior de cloroformo con una pipeta 20 ml con 200 l puntas amarillas de plástico bajo una corriente lenta de N _2. Para ello, un tubo de Tygon se conecta al regulador de la N ₂ tanque. Mantenga el lugar de menos de 1 cm de diámetro. Cada placa tiene capacidad para 10 muestras (al posterior análisis de GLC está previsto).
5. Como los lípidos manchas completamente seca en la campana de humos, preparar el disolvente de desarrollo compuesto de acetona, tolueno, agua (91 ml: 30 ml: 7,5 ml). Si la humedad ambiental relativa del aire es alta, la separación podría ser afectada. En este caso el agua debe ser reducida para dar (91 ml: 30 ml: 7,0 ml) para conseguir la separación deseada.
6. Verter 80 ml de disolvente en el desarrollo de un TLC sellar el desarrollo de la cámara (L: H: W = 27,0: 26,5: 7.0, cm / cm / cm) y se coloca la placa en el tanque con el fin de la muestra hacia abajo. Sellar el tanque con la abrazadera. El disolvente ascenderá la placa y los lípidos se separarse. El tiempo de desarrollo es de aproximadamente 50 minutos a temperatura ambiente.
7. Cuando el frente del disolvente se sitúe a 1 cm de la parte superior de la placa, retire con cuidado la placa de la cubeta y se seque por completo en la campana de humos durante 10 minutos aproximadamente.
8. Lípidos separados por TLC puede ser reversible manchado brevemente con yodo para el análisis cuantitativo o irreversiblemente teñidas con ácido sulfúrico o α-naftol.
   1. Sulfúrico carbonización ácido: Pulverizar la placa con el 50% de ácido sulfúrico en agua en una botella rociadora de vidrio en la campana extractora de humos y hornee a 120 ° C durante 15 minutos (Figura 2).
   2. α-naftol la tinción de glicolípidos: Pulverizar la placa con el 2,4% (w / v) α-naftol en el 10% (v / v) de ácido sulfúrico, 80% (v / v) de etanol y hornee a 120 ° C durante 3-5 minutos hasta que las bandas glicolípido se tiñen de color rosa o púrpura (Figura 2B). El tratamiento excesivo dará lugar a la carbonización de todos los lípidos debido a la presencia de ácido sulfúrico en el reactivo.
   3. Tinción de yodo: en una campana de extracción, se coloca la placa en un tanque cerrado TLC con cristales de yodo (en una bandeja en la parte inferior que conduce a la saturación de la atmósfera con vapor de yodo hasta que los lípidos son visibles). No exponga la placa de yodo mucho tiempo como el yodo covalente puede modificar los ácidos grasos poliinsaturados (Figura 2C). Por otra parte, para evitar la oxidación de los lípidos, sólo los carriles estándar intercalados con los carriles de la muestra debe ser manchada con una lana de vidrio conectado pipeta Pasteur con cristales de yodo a través del cual N ₂ es soplado sobre carriles individuales estándar.

3. Acil éster metílico (FAME) Reacción ¹⁶

1. Eliminar la sílice rodean identificado puntos de lípidos de la placa de TLC con una cuchilla de afeitar. Raspe la sílice que contienen lípidos y transferir el polvo de sílice usando un embudo en un tubo de vidrio con tapón de rosca de teflón (PTFE) a ambos lados.
2. Añadir 1 ml 1 N de ácido clorhídrico (HCl) en metanol anhidro a cada muestra por pipeta.
3. Añadir 100 ml de 50 mg mL ^-1 pentadecanoico ácido (15:00) con una pipeta 200 l de cada muestra como patrón interno con una pipeta 200 l con 200 l punta de plástico amarillo. Mantenga un tubo con sólo ácido pentadecenoic metanólica de HCl como un control. Cerrar los tubos de vidrio herméticamente con tapas recubierto de teflón.
4. Incubar gltubos de culo en un baño de agua de 80 ° C durante 25 minutos. Los tubos deben ser sellados para que el disolvente no se evapora.
5. Después de los tubos se hayan enfriado, añada 1 ml de cloruro de sodio al 0,9% seguido de un ml de hexano y agitar vigorosamente. Centrifugar las muestras a 1000xg durante 3 minutos.
6. En la campana extractora de humos, retire la capa de hexano / superior de la muestra con pipeta Pasteur y colocarla en un tubo de vidrio nuevo 13x100 mm.
7. Evaporar hexano bajo una corriente lenta de N ₂ sin secar por completo.
8. Disolver el resultado acil methylesters s en 60 l de hexano. Transferencia de las muestras en viales muestreador automático y tapa. Las muestras pueden ser almacenadas a 4 ° C para el corto plazo y -20 º C durante unos días.

4. Cromatografía de gas líquido (GLC) ¹⁰

1. Antes de comenzar GLC, asegúrese de que el hidrógeno helio, y los cilindros de aire se llenan.
2. Hexano suficiente hay que añadir a la reserva de disolvente y el contenedor de residuos debe estar vacío. Para la separación de grasas methylesters acilo, adjuntar una DB-23 columna de la máquina.
3. Viales lugar en el inyector automático. Inicie el software ChemStation en la CGL en el sistema informático.
4. Ajuste la temperatura de entrada a 250 ° C con una tasa de flujo de helio a 48.6 ^mL min-1 y la presión a 21,93 psi. La relación de separación es de 30,0: 1.
5. La temperatura del horno se establece inicialmente a 140 ° C durante 2 minutos y elevó a 160 ° C a una velocidad de 25 ° C min ^-1. A continuación, ajuste la temperatura aumentará de 160 ° C a 250 ° C a una velocidad de 8 ° C min ^-1 y mantener a 250 º C durante 4 minutos seguido de una disminución a 140 ° C a una velocidad de 38 ° C min ^{- 1.} Una carrera dura aproximadamente 21 minutos.
6. La temperatura del detector de ionización de llama es de 270 ° C con un caudal de hidrógeno de 30.0 ^mL min-1, la tasa de flujo de aire a 400 ^mL min-1 y la tasa de flujo de helio a 30.0 ^mL min-1.
7. Introduce el número de viales y nombre de la muestra en la tabla de secuencia de ejecución. Ajuste el inyector de 10 l para inyectar 2 l de la muestra por vial.
8. Cuando el instrumento está listo, inicie la secuencia de ejecución.

5. Los resultados representativos:

Ejemplos de tinción irreversible del TLC separados por los lípidos de plantas Arabidopsis de 4 semanas de edad se muestra en la Figura 2. Los lípidos de ácido sulfúrico manchada (Figura 2A) están carbonizados y aparecen como manchas de color marrón. α-naftol se prefiere a la mancha glicolípidos como MGDG, DGDG, SQDG glicolípidos etc teñidas con α-naftol llevar un color rosa-púrpura, mientras que otros lípidos polares mancha amarilla (Figura 2B). La tinción de yodo es reversible y lípidos da un color amarillento que va a desaparecer en un corto tiempo se evapora el yodo (Figura 2C). Lípidos brevemente manchados de yodo puede ser objeto de análisis por GLC a pesar de lípidos sin manchas son preferibles a reducir la descomposición de los lípidos.

Si se hace correctamente, las señales distintivas que representan a diferentes grasos éster metílico de acilo se podrá realizar GLC (Figura 3). Éster metílico de acilo graso con cadena de carbono más cortas y menos enlaces dobles tienen menor tiempo de retención con el DB-23 de la columna. Acil perfiles de éster metílico es una herramienta sensible para identificar mutantes con la composición de lípidos alterados. En la Figura 4, el MGDG18: 3 proporción de ácidos grasos molar se encuentra disminuida en el mutante tgd4-1 en comparación con el tipo salvaje ^{de 18 años.} Dividiendo los moles de éster metílico de acil grasos de los lípidos de clase uno con los moles de todas las clases de lípidos, la relación molar de cada uno de los lípidos se calculan. Por ejemplo, para calcular la proporción molar de MGDG:

(MGDG)% mol = Σ [FAME _(MGDG)] / Σ [FAME _(total)] x 100%

Las proporciones resultantes molar de cada clase de lípidos, tanto la de tipo salvaje y el mutante se puede comparar. Por ejemplo, el mutante tgd4-1 ha aumentado las cantidades relativas de MGDG y PG, pero disminuyeron las cantidades de DGDG y PE (Figura 5) ^18.

Figura 1. Diagrama de flujo del análisis de los lípidos polares con plántulas de Arabidopsis. Lípidos totales se extraen de plantas Arabidopsis de 4 semanas de edad, y separados por TLC. Los lípidos separados puede ser raspado de la placa de TLC para la transesterificación seguida de análisis por GLC.

Figura 2. Separación de los lípidos en las placas de TLC. Extractos de lípidos de 35 mg (peso fresco) plántulas de tipo silvestre están separados por TLC y teñidas por el ácido sulfúrico (A), α-naftol (B) o el vapor de yodo (C). Tres repeticiones se muestran en cada método de tinción. DGDG, digalactosyldiacylglycerol; MGDG, monogalactosyldiacylglycerol; PC, la fosfatidilcolina, PE, fosfatidiletanolamina, PG, phosphatidylglycerol, PI, fosfatidilinositol, SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol.

Figura 3. Análisis por GLC de Methylesters ácidos grasos (FAME) derivado de MGDG del tipo salvaje. FAME se separan en una columna de 30 m capilar y detectados por ionización de llama. Pentadecanoico ácido (15:00) se utiliza como estándar interno.

Figura 4. Perfil de ácidos grasos de MGDG en el tipo salvaje Col2 (columnas blancas) y el tgd4-1 mutante (columnas de negro). Los ácidos grasos se presentan como el número de carbonos seguido por el número de dobles enlaces. Tres repeticiones se hacen un promedio y las desviaciones estándar se muestran.

Figura 5. Composición de los lípidos polares del tipo salvaje Col2 (columnas blancas) y el tgd4-1 mutante (columnas de negro). Tres repeticiones se hacen un promedio y las desviaciones estándar se muestran con barras de error.

Discusión

TLC, junto con GLC proporciona una herramienta robusta y rápida para el análisis cuantitativo de los lípidos polares en las plantas. Pequeños cambios en la composición de los lípidos se pueden identificar, por lo tanto, este método ha sido utilizado para la detección a gran escala de los mutantes de alteración en los lípidos polares vías metabólicas ^1,20. Este método también se usa ampliamente para las actividades de control de las enzimas que utilizan los lípidos polares como sustrato. ^2,6,7

Además de las hojas, la composición de los lípidos de los tejidos vegetales tales como las raíces y las semillas o fracciones subcelulares como los cloroplastos y las mitocondrias también se puede determinar de la misma manera.

El sistema de solventes (acetona, tolueno, agua) que se utiliza aquí está optimizado para la separación de glicolípidos y fosfolípidos en las plantas. Sin embargo, en tgd1, 2,3,4 mutantes y los cloroplastos aislados, TGDG corre junto con el PE, mientras que tetragalactosyldiacylglycerol funciona con PC. En este caso, un sistema disolvente de cloroformo, metanol, ácido acético y agua (85: 20: 10: 4, v / v / v / v) se utiliza ^13. A veces, una TLC bidimensional utilizando dos sistemas de solventes diferentes se realiza para separar aún más glicolípidos y fosfolípidos ^19. Además, los tejidos de las plantas pueden estar directamente sometidos a la reacción FAME seguido por GLC para determinar el perfil de ácidos grasos totales, sin separación inicial de TLC ^5. Junto a la demostrada TLC-GLC sistema, otro método utilizado para la creación de perfiles de lípidos se basa en la ionización directa de masas electrospray tandem espectrometría ^17. En este método la separación cromatográfica inicial de lípidos en el extracto se omite. Sin embargo, este método requiere un equipo costoso y personal experimentado, que hace que sea menos útil para los análisis de rutina en el laboratorio o para la detección de mutantes.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
α-naphthol	Sigma-Aldrich	N1000
Methanolic HCL 3N	Sigma-Aldrich	33050-U	Dilute to 1N by methanol
Si250-PA TLC plates	JT Baker	7003-04	With pre-absorbent
TLC chamber	Sigma-Aldrich	Z266000
Screw cap tubes	VWR international	53283-800
Scew caps	Sun Sri	13-425
PTFE disk	Sun Sri	200 608
GLC system	Hewlett-Packard	HP6890
DB-23 column	J&W Scientific	122-2332
GLC vials	Sun Sri	500 132
Caps of GLC vials	Sun Sri	201 828
Chemstation software	Agilent Technologies	G2070AA