Thaliana ארבידופסיס פולאר Glycerolipid פרופיל ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) יחד עם כרומטוגרפיה גז נוזלי (GLC)

Summary

הרכב תמציות השומנים הקוטב הרכב חומצות שומן של glycerolipids הפרט נקבעים ניסוי פשוט חזקים פרופיל השומנים. לענין זה, glycerolipids מבודדים על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה נתונה transmethylation של קבוצות acyl שלהם. Methylesters acyl שומן הם לכמת ידי כרומטוגרפיה גז נוזלי.

Abstract

ביולוגית ממברנות תאים נפרדים מהסביבה. מתא יחיד צמחים ובעלי חיים תאיים, glycerolipids, כגון phosphatidylcholine או phosphatidylethanolamine, bilayer טופס ממברנות אשר ישמש הן גבולות וממשקים לחילופי כימית בין התאים וסביבתם. שלא כמו בעלי חיים, בתאי צמח יש אברון מיוחד הפוטוסינתזה, הכלורופלסט. מערכת קרום המורכב של הכלורופלסט מכיל glycerolipids ייחודי, כלומר glycolipids חסר זרחן: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) ^4. התפקידים של שומנים אלה הם מעבר מבניים פשוט. Glycolipids אלה glycerolipids אחרים נמצאו מבנים גבישיים של photosystem I ו-II המעידים על מעורבות של glycerolipids בפוטוסינתזה ^8,11. במהלך רעב פוספט, DGDG מועבר ממברנות extraplastidic כדי לפצות על אובדן פוספוליפידים ^9,12.

רוב הידע שלנו על ביוסינתזה והתפקוד של שומנים אלה כבר נגזר משילוב של מחקרים גנטיים ביוכימיים עם ¹⁴ thaliana ארבידופסיס. במהלך מחקרים אלו, הליך פשוט לניתוח של שומנים קוטביים כבר חיוני ההקרנה וניתוח של מוטנטים שומנים יפורטו בפירוט. תמצית השומנים עלה מופרד לראשונה על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) ו glycerolipids מוכתמות הפיך עם אדי יוד. שומנים בודדים מגורד מהצלחת TLC המרה methylesters acyl שומן (FAMEs), אשר מנותחות על ידי גז כרומטוגרפיה נוזלית, יחד עם גילוי אש יינון (FID-GLC) (איור 1). שיטה זו הוכחה להיות כלי אמין להקרנה מוטציה. לדוגמה, tgd1, 2,3,4 endoplasmic reticulum-to-plastid סחר מוטנטים השומנים התגלו על בסיס הצטברות של galactoglycerolipid חריג: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) וירידה בשיעור היחסי של 18:03 (פחמנים: כפול אג"ח) קבוצות acyl שומן שומנים קרום ^3,13,18,20. שיטה זו היא גם רלוונטי לקביעת פעילות אנזימטית של חלבונים באמצעות שומנים כמו המצע ^6.

Protocol

1. ליפידים Extraction

1. בגין שאיבת שומן על ידי קצירת 30 מ"ג 4 שבועות בת ארבידופסיס עלים מצמחים הגדלים על אגר הקרושה בינוני או אדמה ולהעביר אותם לתוך צינורות פוליפרופילן 1.5 מ"ל התגובה. עלים טריים ניתן פלאש קפואים בחנקן נוזלי המאוחסן ב -80 ° C.
2. הוספת 300 החילוץ μL ממס מורכב מתנול, כלורופורם ו חומצה פורמית (20:10:01, V / v / v) מדגם אחד. Shake במרץ (באמצעות צבע שייקר או דומה) במשך 5 דקות.
3. הוספת 150 μL של חומצה זרחתית M 0.2 (H ₃ PO _4), 1 מ כלוריד האשלגן (KCl) ו בקצרה מערבולת.
4. צנטריפוגה ב XG 13,000 בטמפרטורת החדר למשך דקה 1. ליפידים מומס בשלב כלורופורם התחתון יהיה הבחין לצלחות TLC.

2. כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) ¹⁵

1. כדי להכין צלחות TLC, לצלול סיליקה ג'ל 20cmx20cm מצופה TLC צלחת עם פס טעינה של 30 שניות לתוך M 0.15 אמוניום סולפט ((NH _{4) 2} SO ₄₎ פתרון, לאחר השריית למשך 30 שניות, יבש את הצלחת לפחות 2 ימים מיכל מכוסה. במהלך הפעלת סובלימציה של אמוניום משאיר מאחוריו חומצה גופרתית, אשר protonates phosphatidylglycerol הכרחי ההפרדה שלה glycerolipids אחרים.
2. ביום הניסוי, להפעיל TLC צלחות על ידי אפייה בתנור על 120 מעלות צלזיוס במשך 2.5 שעות.
3. לאחר הרגעות צלחות מופעל לטמפרטורת החדר, יש להשתמש בעיפרון כדי לצייר קו ישר (1.5 ס"מ משולי הצלחת) על פני הצלחת המקור של chromatogram.
4. במנדף קטר, לאט לספק 3 X 20 μL של תמצית השומנים בשלב כלורופורם נמוך באמצעות פיפטה 20 μL עם 200 טיפים μL פלסטיק צהוב תחת זרם איטי של N _2. לענין זה, Tubing Tygon מחובר הרגולטור של הטנק N _2. שמרו על המקום קטן יותר מאשר 1 ס"מ קוטר. הצלחת כל יכול להכיל עד 10 דגימות (כאשר לאחר מכן ניתוח GLC מתוכנן).
5. כמו שומנים הנקודות להתייבש לחלוטין בשכונה קטר, להכין את הממס פיתוח מורכב של אצטון, טולואן, מים (91 מ"ל: 30 מ"ל: 7.5 מ"ל). אם רמת הלחות באוויר הסביבה היא גבוהה יחסית, ההפרדה עשויים להיות מושפעים. במקרה זה מים צריך להיות מופחת לתת (91 מ"ל: 30 מ"ל: 7.0 מ"ל) כדי להשיג את ההפרדה הרצויה.
6. יוצקים 80 מ"ל בפיתוח ממס לתוך TLC סגר פיתוח תא (L: H: W = 27.0: 26.5: 7.0 ס"מ / ס"מ / ס"מ) ומניחים את הצלחת לתוך הטנק עם סוף מדגם כלפי מטה. חותם את הטנק באמצעות מהדק. ממס יהיה לעלות את הצלחת שומנים יופרדו. זמן הפיתוח הוא כ 50 דקות בטמפרטורת החדר.
7. כאשר הגיע מול ממס 1 ס"מ מהחלק העליון של הצלחת, להסיר בזהירות את הצלחת מהטנק ויבש לחלוטין למכסה המנוע קטר במשך כ -10 דקות.
8. ליפידים מופרדות TLC יכול להיות מוכתם הפיך בקצרה עם יוד על ניתוח כמותי או מוכתמת באופן בלתי הפיך עם חומצה גופרתית או α-naphthol.
   1. חומצה גופרתית לחריכה: לרסס את הצלחת עם חומצה גופרתית 50% מים בבקבוק זכוכית ספריי בשכונה קטר ואופים בחום של 120 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות (איור 2 א).
   2. α-naphthol מכתים עבור glycolipids: לרסס את הצלחת עם 2.4% (w / v) α-naphthol ב -10% (v / v) חומצה גופרתית, 80% (v / v) אתנול ואופים בחום של 120 מעלות צלזיוס במשך 3-5 דקות עד להקות glycolipid מוכתמות ורוד או סגול (תרשים 2B). טיפול יתר יוביל לחריכה של כל השומנים בשל נוכחותם של חומצה גופרתית ב מגיב.
   3. מכתים יוד: במנדף קטר, במקום את הצלחת לתוך טנק TLC סגור עם גבישי יוד (במגש בתחתית המוביל הרוויה של האווירה עם אדי יוד עד שומנים גלויים). אל תחשוף את צלחת יוד מדי זמן יוד עשוי לשנות קוולנטית חומצות שומן רב בלתי רווי (איור 2C). לחלופין, כדי למנוע חמצון של שומנים, רק נתיבים תקן וביניהם מסלולי מדגם צריך להיות מוכתם באמצעות צמר זכוכית פקוק פיפטה פסטר עם גבישי יוד שדרכו N ₂ הוא התפוצץ מעל נתיבי תקן בודדים.

3. שומן Acyl Methylester (תהילה) תגובה ¹⁶

1. הסרת כתמים סביב סיליקה מזוהה השומנים מהצלחת TLC בסכין גילוח. לגרד את השומנים המכיל סיליקה ולהעביר את אבקת סיליקה באמצעות משפך לתוך שפופרת זכוכית עם מכסה טפלון (PTFE) מצופה בורג.
2. הוסף 1 מ"ל 1 N מימן כלורי (HCL) של מתנול anhydrous לטעום כל פיפטה על ידי זכוכית.
3. מוסיפים 100 מ"ל μL 50 מיקרוגרם חומצה pentadecanoic ^-1 (15:00) באמצעות פיפטה 200 μL לטעום כל כסטנדרט פנימי בעזרת פיפטה 200 μL עם קצה פלסטיק μL 200 צהוב. שמור צינור עם חומצה רק pentadecenoic ב methanolic HCl כביקורת. צינורות זכוכית סגור היטב עם טפלון עטורי כיפות.
4. דגירה glהתחת צינורות אמבטיה 80 מעלות צלזיוס מים במשך 25 דקות. צינורות צריך להיות אטום כדי ממס אינו להתאדות.
5. אחרי צינורות יש התקרר, מוסיפים 1 מ"ל נתרן כלוריד 0.9% ואחריו הקסאן מ"ל 1 ו מערבולת במרץ. צנטריפוגה דגימות 1000xg במשך 3 דקות.
6. ב למכסה המנוע קטר, להסיר את שכבת הקסאן / העליון של המדגם עם פיפטה פסטר והנח אותו לתוך צינור חדש זכוכית 13x100 מ"מ.
7. להתאדות הקסאן תחת זרם איטי של N ₂ ללא ייבוש לחלוטין.
8. ממיסים את שומן וכתוצאה מכך acyl methylesters s ב הקסאן 60 μL. העברת דגימות autosampler לתוך צלוחיות כובע בחוזקה. דוגמאות ניתן לאחסן 4 ° C לטווח קצר -20 ° C למשך כמה ימים.

4. גז נוזלי כרומטוגרפיה (GLC) ¹⁰

1. לפני תחילת GLC, ודא מימן הליום, מיכלי אוויר מלאים.
2. הקסאן מספיק יש להוסיף את המאגר ממס מיכל הפסולת חייבת להיות ריקה. עבור הפרדה methylesters שומן acyl, לצרף DB-23 טור למכונה.
3. המקום לתוך צלוחיות autosampler. הפעל את התוכנה Chemstation עבור GLC במחשב המערכת.
4. קבע את טמפרטורת כניסת ב 250 ° C עם קצב הזרימה הליום ב 48.6 דקות מ"ל ^-1 ואת הלחץ על 21.93 psi. יחס הפיצול הוא 30.0: 1.
5. טמפרטורת התנור נקבע בתחילה עבור 2 דקות ב 140 מעלות צלזיוס, הועלה ל 160 מעלות בקצב של 25 ° C ^-1 דקות. ואז להגדיר את הטמפרטורה להגדיל מ 160 ° C עד 250 ° C בשיעור של 8 ° C ^-1 דקות ולהחזיק ב 250 מעלות צלזיוס במשך 4 דקות לאחר מכן ירידה עד 140 ° C בשיעור של 38 ° C דקות ^{- 1.} אחת לרוץ לוקח כ 21 דקות.
6. הטמפרטורה של גלאי יינון הלהבה היא 270 ° C עם קצב זרימת מימן 30.0 מ"ל ^-1 דקות, קצב זרימת אוויר ב 400 מ"ל ו ^-1 דקות הליום קצב הזרימה ב 30.0 דקות ^-1 מ"ל.
7. הזן את מספר צלוחיות שמות מדגם בטבלה רצף הריצה. הגדר את 10 μL מזרק להזריק 2 מדגם μL לכל בקבוקון.
8. כאשר המכשיר מוכן ליזום את רצף הריצה.

5. נציג תוצאות:

דוגמאות מכתים בלתי הפיך של TLC מופרד שומנים מן 4 שבועות בת שתילים ארבידופסיס מוצגות באיור 2. שומנים חומצה גופרתית צבעונית (איור 2 א) הם חרוך להופיע כתמים חומים. α-naphthol הוא העדיף כתם glycolipids כגון MGDG, DGDG, SQDG וכו Glycolipids מוכתם α-naphthol לשאת צבע ורוד סגול ואילו שומנים הקוטב השני כתם צהוב (איור 2B). מכתים יוד הוא הפיך והוא נותן שומנים צבע צהבהב זה ייעלם עם הזמן קצר כמו יוד מתאדה (איור 2C). יוד בקצרה שומנים מוכתם יכולה להיות נתונה ניתוח GLC למרות שומנים בלא כתם עדיפים להפחית לשבור של שומנים.

אם נעשה בהצלחה, אותות ייחודיים המייצגים שונה שומן acyl methylester יקויימו לאחר GLC (איור 3). Methylester acyl שומן עם שרשרת פחמן קצרות יותר קשרים כפולים יש פחות זמן השמירה קצר באמצעות DB-23 טור. שומן פרופיל acyl methylester הוא כלי רגיש לזיהוי מוטציות עם הרכב השומנים שונה. באיור 4, MGDG18: 3 יחס חומצת שומן טוחנת הוא ירד מוטציה tgd4-1 לעומת סוג בר ^18. על ידי חלוקת שומות של שומן acyl methylester עבור בכיתה אחת השומנים עם שומות של כל המעמדות שומנים בדם, יחס טוחנת של כל השומנים מחושבים. לדוגמה, כדי לחשב את יחס טוחנת של MGDG:

(MGDG)% mol = Σ [FAMEs _(MGDG)] / Σ [FAMEs _(סה"כ)] x100%

יחס טוחנת וכתוצאה מכך של כל שיעור השומנים מסוג שני בר מוטציה ניתן להשוות. למשל, מוטציה tgd4-1 גדל כמויות היחסי של MGDG ו PG אבל ירד סכומי DGDG ו-PE (איור 5) ^18.

1. תרשים זרימה תרשים של ניתוח השומנים הקוטב באמצעות שתילים ארבידופסיס. שומנים סך המחולצים 4 שבועות בת שתילים ארבידופסיס ו מופרדים על ידי TLC. שומנים מופרדות ניתן מגורד מהצלחת TLC עבור transesterification ואחריו ניתוח GLC.

איור 2. ההפרדה של שומנים על צלחות TLC. תמציות של ליפידים של 35 מ"ג (משקל טרי) שתילים סוג בר מופרדות TLC ומוכתמת על ידי חומצה גופריתית (A), α-naphthol (ב) או אדי יוד (C). שלוש חוזר מוצגים כל שיטה מכתים. DGDG, digalactosyldiacylglycerol;, MGDG monogalactosyldiacylglycerol: PC, phosphatidylcholine; PE, phosphatidylethanolamine: PG, phosphatidylglyceרול; PI, phosphatidylinositol; SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol.

איור 3. ניתוח GLC Methylesters של חומצות שומן (FAMEs) נגזר MGDG מסוג בטבע. FAMEs מופרדים על עמודה מ 30 נימי זוהה על ידי יינון להבה. Pentadecanoic חומצה (15:00) משמש כסטנדרט פנימי.

איור 4. פרופיל חומצת שומן של MGDG בסוג בר col2 (עמודות לבן) ואת tgd4-1 מוטציה (עמודות שחורות). חומצות שומן מוצגים מספר פחמנים ואחריו מספר קשרים כפולים. שלוש חזרות הם ממוצעים וסטיות תקן מוצגים.

איור 5. הרכב שומנים פולאר מסוג בר col2 (עמודות לבן) ואת tgd4-1 מוטציה (עמודות שחורות). שלוש חזרות הם ממוצעים וסטיות תקן מוצגים על ידי בר שגיאה.

Discussion

TLC יחד עם GLC מספק כלי חזק ומהיר עבור ניתוח כמותי של שומנים קוטביים בצמחים. שינויים קטנים בהרכב השומנים ניתן לזהות, ולכן בשיטה זו נעשה שימוש להקרנה בקנה מידה גדול של מוטנטים לקויי הקוטב מסלולים מטבוליים השומנים ^1,20. שיטה זו היא גם בשימוש נרחב עבור פעילויות ניטור של אנזימים ניצול שומנים קוטבי כמו המצע. ^2,6,7

מלבד עלים, הרכב השומנים של רקמות הצמח אחרים כמו שורשים וזרעים או שברים subcellular כגון כלורופלסטים ואת המיטוכונדריה יכול להיות גם נקבע באותו אופן.

המערכת ממיס (אצטון, טולואן, מים), המשמש כאן הוא מותאם להפרדת glycolipids ו פוספוליפידים בצמחים. עם זאת, tgd1, 2,3,4 ו מוטנטים כלורופלסטים מבודדים, TGDG פועל יחד עם PE בעוד tetragalactosyldiacylglycerol רץ עם מחשב. במקרה זה מערכת ממס עם חומצה כלורופורם, מתנול אצטית ומים (85: 20: 10: 4, v / v / v / v) משמש ^13. לפעמים דו מימדי TLC באמצעות שתי מערכות שונות ממס מבוצע על glycolipids נפרד נוסף פוספוליפידים ^19. בנוסף, רקמות הצמח יכול להיות כפופים ישירות התגובה תהילה ואחריו GLC כדי לקבוע את פרופיל הכולל חומצת שומן ללא הפרדה ראשונית על TLC ^5. לצד TLC-GLC הפגינו מערכת, שיטה נוספת המשמשת פרופיל השומנים מבוסס על יינון ישיר מסה electrospray טנדם ספקטרומטריית ^17. בשיטה זו ההפרדה chromatographic ראשוני של שומנים לחלץ את מושמט. עם זאת, שיטה זו דורשת ציוד יקר וכוח אדם מנוסה, מה שהופך אותו פחות שימושי עבור ניתוחים שגרתי במעבדה או להקרנה מוטציה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
α-naphthol	Sigma-Aldrich	N1000
Methanolic HCL 3N	Sigma-Aldrich	33050-U	Dilute to 1N by methanol
Si250-PA TLC plates	JT Baker	7003-04	With pre-absorbent
TLC chamber	Sigma-Aldrich	Z266000
Screw cap tubes	VWR international	53283-800
Scew caps	Sun Sri	13-425
PTFE disk	Sun Sri	200 608
GLC system	Hewlett-Packard	HP6890
DB-23 column	J&W Scientific	122-2332
GLC vials	Sun Sri	500 132
Caps of GLC vials	Sun Sri	201 828
Chemstation software	Agilent Technologies	G2070AA