Arabidopsis thaliana profilage glycolipides polaires par chromatographie sur couche mince (CCM) couplée à la chromatographie gaz-liquide (GLC)

Résumé

Composition des extraits lipidiques polaires et la composition en acides gras de glycérolipides individuels sont déterminés dans une expérience de profilage des lipides simples et robustes. À cette fin, glycérolipides sont isolés par chromatographie sur couche mince et soumis à transméthylation de leurs groupes acyle. Fatty acyl esters méthyliques sont quantifiés par chromatographie gaz-liquide.

Résumé

Biologique des cellules des membranes distincte de l'environnement. D'une cellule unique pour les plantes et les animaux multicellulaires, glycérolipides, tels que la phosphatidylcholine ou la phosphatidyléthanolamine, membranes bicouches forme qui agissent à la fois comme des limites et des interfaces pour l'échange chimique entre les cellules et leur environnement. Contrairement aux animaux, les cellules végétales ont un organite spéciale pour la photosynthèse, les chloroplastes. Le système de membrane du chloroplaste complexes glycérolipides contient uniques, à savoir glycolipides manque de phosphore: monogalactosyldiacylglycérol (MGDG), digalactosyldiacylglycérol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) ^4. Les rôles de ces lipides sont tout simplement au-delà des structures. Ces glycolipides et glycérolipides autres ont été trouvés dans les structures cristallines du photosystème I et II indiquant l'implication de glycérolipides dans la photosynthèse ^8,11. Pendant la famine de phosphate, DGDG est transféré sur des membranes extraplastidic pour compenser la perte de phospholipides ^9,12.

Une grande partie de notre connaissance de la biosynthèse et la fonction de ces lipides a été dérivé d'une combinaison d'études génétiques et biochimiques de ¹⁴ Arabidopsis thaliana. Durant ces études, une procédure simple pour l'analyse des lipides polaires a été essentiel pour le dépistage et l'analyse des lipides et des mutants seront décrites en détail. Un extrait lipidique des feuilles est d'abord séparés par chromatographie sur couche mince (CCM) et glycérolipides sont colorées de manière réversible avec la vapeur d'iode. Les lipides individuels sont grattées de la plaque de CCM et convertis en esters méthyliques gras acyle (FAME), qui sont analysés par chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur à ionisation de flamme (FID-GLC) (figure 1). Cette méthode a été prouvée pour être un outil fiable pour le dépistage du mutant. Par exemple, le tgd1, 2,3,4 réticulum endoplasmique-à-plastes mutants trafic de lipides ont été découvertes basées sur l'accumulation d'une galactoglycerolipid anormale: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) et une diminution de la quantité relative de 18h03 (carbones: double obligations) groupes acyle gras dans les lipides de la membrane ^3,13,18,20. Cette méthode est également applicable pour la détermination des activités enzymatiques de protéines en utilisant des lipides comme substrat ^6.

Protocole

1. L'extraction des lipides

1. Commencez l'extraction des lipides par la récolte de 30 mg feuilles d'Arabidopsis 4 semaines d'âge à partir de plantes cultivées sur gélose solidifiée moyen ou le sol et les transférer dans des tubes de 1,5 ml en polypropylène réaction. Les feuilles fraîches peuvent être éclair congelés dans l'azote liquide et stockés à -80 ° C.
2. Ajouter 300 uL d'extraction solvant composé de méthanol, le chloroforme et l'acide formique (20:10:01, v / v / v) pour chaque échantillon. Agiter vigoureusement (à l'aide d'une peinture ou un shaker similaire) pendant 5 minutes.
3. Ajouter 150 ul de 0,2 M d'acide phosphorique (H ₃ PO _4), 1 M de chlorure de potassium (KCl) et brièvement au vortex.
4. Centrifuger à 13000 xg à température ambiante pendant 1 minute. Les lipides dissous dans la phase inférieure chloroformique seront déposés sur des plaques de CCM.

2. Chromatographie sur couche mince (CCM) ¹⁵

1. Pour préparer des plaques de CCM, immerger un gel de silice TLC 20cmx20cm plaque recouverte de chargement de bande de 30 sec en sulfate d'ammonium 0,15 M ((NH _{4) 2} SO ₄₎ solution, après avoir submergé pendant 30 secondes, sèche la plaque pendant au moins 2 jours dans un récipient couvert. Lors de l'activation de la sublimation de l'ammonium laisse derrière lui l'acide sulfurique, qui protone phosphatidylglycérol nécessaires à sa séparation d'avec les autres glycérolipides.
2. Le jour de l'expérience, d'activer TLC plaques par cuisson dans un four à 120 ° C pendant 2,5 heures.
3. Après refroidissement les plaques activées à la température ambiante, utilisez un crayon pour dessiner une ligne droite (1,5 cm du bord de la plaque) sur la plaque à l'origine du chromatogramme.
4. Dans une hotte, lentement livrer 3 X 20 pi d'extrait lipidique dans la phase inférieure chloroformique aide d'une pipette 20 pl avec 200 pi jaunes pointes en plastique sous un faible courant de N _2. À cette fin, un tube Tygon est relié au régulateur de la N ₂ réservoir. Gardez le spot inférieure à 1 cm de diamètre. Chaque plaque peut contenir jusqu'à 10 échantillons (lorsque l'analyse ultérieure GLC est prévu).
5. Comme les lipides taches complètement sec dans la hotte, préparer le solvant de développement composé d'acétone, de toluène, de l'eau (91 ml: 30 ml: 7,5 ml). Si l'humidité de l'air ambiant relative est élevée, la séparation pourrait être affectée. Dans ce cas, l'eau doit être réduite pour donner (91 ml: 30 ml: 7,0 ml) pour obtenir la séparation souhaitée.
6. Verser 80 ml solvant de développement dans un TLC refermable développement de chambre (L: H: W = 27,0: 26,5: 7,0, cm / cm / cm) et placer la plaque dans la cuve avec la fin de l'échantillon vers le bas. Sceau de la cuve à l'aide de la pince. Le solvant montera sur le plateau et les lipides seront séparés. Le temps de développement est d'environ 50 minutes à température ambiante.
7. Lorsque le front du solvant a atteint 1 cm du haut de la plaque, enlevez soigneusement la plaque de la cuve et le sécher dans la hotte pendant 10 minutes environ.
8. Lipides séparés par CCM peut être réversible teinté brièvement avec de l'iode pour l'analyse quantitative ou irréversiblement coloré avec l'acide sulfurique ou α-naphtol.
   1. Carbonisation d'acide sulfurique: la plaque de pulvérisation avec de l'acide sulfurique à 50% dans de l'eau dans un vaporisateur en verre dans la hotte et cuire au four à 120 ° C pendant 15 minutes (figure 2A).
   2. α-naphtol coloration pour glycolipides: pulvériser la plaque avec 2,4% (p / v) α-naphtol dans 10% (v / v) d'acide sulfurique, 80% (v / v) d'éthanol et cuire au four à 120 ° C pendant 3-5 minutes jusqu'à ce que les bandes glycolipide sont colorés roses ou pourpres (figure 2B). Surtraitement mènera à la carbonisation de toutes les lipides due à la présence d'acide sulfurique dans le réactif.
   3. Coloration à l'iode: dans une hotte, placer la plaque dans une cuve fermée avec TLC cristaux d'iode (dans un bac sur le fond conduisant à une saturation de l'atmosphère avec la vapeur d'iode jusqu'à ce lipides sont visibles). Ne pas exposer la plaque à l'iode trop longtemps que l'iode peut modifier de façon covalente des acides gras polyinsaturés (figure 2C). Sinon, pour éviter toute oxydation des lipides, des voies réservées aux standards entrecoupées de ruelles échantillon doit être teinté en utilisant une laine de verre bouché pipette Pasteur avec des cristaux d'iode à travers lequel le N ₂ est soufflé individuels voies standard.

3. Acyl ester méthylique (FAME) Réaction ¹⁶

1. Retirez la silice entourant taches lipides identifiés à partir de la plaque de CCM avec une lame de rasoir. Grattez la silice et le transfert lipidique contenant la poudre de silice en utilisant un entonnoir dans un tube en verre avec un bouchon à vis en téflon (PTFE)-alignés.
2. Ajouter 1 mL 1 N d'acide chlorhydrique (HCl) dans le methanol anhydre pour chaque échantillon en verre pipette.
3. Ajouter 100 uL 50 pg ml ^-1 pentadécanoïque acide (15h00) avec 200 uL pipette pour chaque échantillon comme étalon interne à l'aide d'une pipette 200 ul avec 200 uL embout en plastique jaune. Gardez un tube avec seulement l'acide pentadecenoic de HCl méthanolique comme un contrôle. Fermer les tubes en verre hermétiquement avec téflon bouchons.
4. Incuber gltubes cul dans une 80 ° C bain-marie pendant 25 minutes. Tubes doivent être scellés de telle sorte que le solvant ne s'évapore pas.
5. Après les tubes ont refroidi, ajouter 1 ml de chlorure de sodium à 0,9%, suivi par une mL d'hexane et vortexer vigoureusement. Centrifuger les échantillons à 1000xg pendant 3 minutes.
6. Dans la hotte, enlever la couche d'hexane / supérieure de l'échantillon avec une pipette Pasteur et le placer dans un nouveau tube en verre 13x100 mm.
7. Evaporer l'hexane sous un faible courant de N ₂ sans sécher complètement.
8. Dissoudre le résultant acyl esters méthyliques s dans 60 uL d'hexane. Transfert des échantillons dans des flacons échantillonneur automatique et bouchon. Les échantillons peuvent être conservés à 4 ° C pour le court terme et -20 ° C pendant quelques jours.

4. Chromatographie gaz-liquide (GLC) ¹⁰

1. Avant de commencer GLC, s'assurer que l'hélium, l'hydrogène et des bouteilles d'air sont remplis.
2. Hexane suffisante doit être ajoutée au réservoir de solvant et le conteneur à déchets doit être vide. Pour la séparation gras esters méthyliques d'acyle, joignez une DB-23 colonne à la machine.
3. Placez les flacons dans l'échantillonneur automatique. Démarrez le logiciel Chemstation pour GLC sur l'ordinateur du système.
4. Réglez la température d'entrée à 250 ° C avec un débit d'hélium à 48,6 mL ^-1 min et la pression à 21.93 psi. Le rapport de division est de 30,0: 1.
5. La température du four est fixé initialement à 140 ° C pendant 2 min et porté à 160 ° C à une vitesse de 25 ° C min ^-1. Ensuite, réglez la température pour augmenter de 160 ° C à 250 ° C à une vitesse de 8 ° C min ^-1 et maintenir à 250 ° C pendant 4 min suivie d'une baisse à 140 ° C à une vitesse de 38 ° C min ^{- 1.} Une descente prend environ 21 minutes.
6. La température du détecteur à ionisation de flamme est de 270 ° C avec un débit d'hydrogène de 30,0 ml min ^-1, débit d'air à 400 mL ^-1 min et le débit de l'hélium à 30,0 mL ^-1 min.
7. Entrez le nombre de flacons et les noms de l'échantillon dans le tableau séquence d'exécution. Réglez l'injecteur 10 uL d'injecter un échantillon de 2 l par flacon.
8. Lorsque l'instrument est prêt, lancer la séquence de courir.

5. Les résultats représentatifs:

Exemples de coloration irréversible des TLC séparés lipides à partir de plants d'Arabidopsis 4 semaines d'âge sont représentées dans la figure 2. Les lipides d'acide sulfurique coloré (figure 2A) sont carbonisés et apparaissent comme des taches brunes. α-naphtol est préférable de teindre des glycolipides tels que MGDG, DGDG, SQDG glycolipides etc colorés avec α-naphtol mener une couleur rose-violet tandis que d'autres lipides polaires tache jaune (figure 2B). La coloration à l'iode est réversible et donne une couleur jaunâtre lipides qui vont disparaître sur une courte période comme l'iode s'évapore (figure 2C). Lipides d'iode brièvement tachés peuvent être soumises à une analyse GLC bien lipides non colorés sont préférables pour réduire briser des lipides.

Si c'est fait avec succès, des signaux distinctifs représentant différents acyl ester méthylique sera observée après CGL (figure 3). Fatty ester méthylique d'acyle avec la chaîne carbonée plus courte et moins de doubles liaisons ont temps de rétention en utilisant le DB-23 de la colonne. Acyl ester méthylique de profilage est un outil sensible pour identifier les mutants avec la composition lipidique altéré. Dans la figure 4, la MGDG18: 3 ratio d'acides gras molaire est diminué chez le mutant tgd4-1 par rapport au type sauvage ^18. En divisant les moles de acyl ester méthylique pour une classe de lipides avec les taupes de toutes les classes de lipides, le rapport molaire de chaque lipide sont calculés. Par exemple, pour calculer le ratio molaire de MGDG:

(MGDG) mol% =% x100 Σ [FAME _(MGDG)] / Σ [FAME _(total)]

Les ratios molaires résultant de chaque classe de lipides à la fois du type sauvage et le mutant peut être comparé. Par exemple, le mutant tgd4-1 a augmenté les quantités relatives de la MGDG et PG, mais diminué des montants de DGDG et PE (figure 5) ^18.

Organigramme Figure 1. De l'analyse des lipides polaires en utilisant des plants d'Arabidopsis. Les lipides totaux sont extraits des plants d'Arabidopsis de 4 semaines, âgé et séparés par CCM. Les lipides peuvent être séparés raclées plaque de CCM pour la transestérification suivie par l'analyse GLC.

Figure 2. Séparation des lipides sur des plaques de CCM. Extraits lipidiques de 35 mg (poids frais) des plants de type sauvage sont séparés par CCM et colorées par l'acide sulfurique (A), α-naphtol (B) ou des vapeurs d'iode (C). Trois répétitions sont indiquées dans chaque méthode de coloration. DGDG, digalactosyldiacylglycérol; MGDG, monogalactosyldiacylglycérol; PC, la phosphatidylcholine, PE, la phosphatidyléthanolamine, PG, phosphatidylglycerol; PI, phosphatidylinositol; SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol.

Figure 3. Analyse GLC d'esters méthyliques d'acides gras (FAME) dérivés de MGDG de type sauvage. FAME sont séparés sur une colonne capillaire de 30 m et détectés par ionisation de flamme. Pentadécanoïque acide (15:00) est utilisé comme standard interne.

Figure 4. Profil des acides gras MGDG dans le type sauvage Col2 (colonnes blanches) et les tgd4-1 mutante (colonnes noires). Les acides gras sont présentées comme le nombre de carbones suivie par le nombre de doubles liaisons. Trois répétitions sont en moyenne et les écarts types sont représentés.

Figure 5. Polar composition des lipides de type sauvage Col2 (colonnes blanches) et les tgd4-1 mutante (colonnes noires). Trois répétitions sont en moyenne et les écarts types sont représentés par des barres d'erreur.

Discussion

TLC couplé avec CGL offre un outil robuste et rapide pour l'analyse quantitative des lipides polaires dans les plantes. De petits changements dans la composition lipidique peut être identifié, par conséquent, cette méthode a été utilisée pour le dépistage à grande échelle des mutants déficients dans les régions polaires des voies métaboliques des lipides ^1,20. Cette méthode est également largement utilisé pour les activités de surveillance des enzymes utilisant des lipides polaires comme substrat. ^2,6,7

Outre les feuilles, la composition lipidique des autres tissus végétaux comme les racines et les graines ou les fractions subcellulaires comme les chloroplastes et les mitochondries peuvent également être déterminés de la même manière.

Le système de solvants (acétone, toluène, eau) utilisé ici est optimisé pour la séparation des glycolipides et des phospholipides dans les plantes. Cependant, dans tgd1, 2,3,4 mutants et les chloroplastes isolés, TGDG s'exécute avec PE tandis tetragalactosyldiacylglycerol fonctionne avec un PC. Dans ce cas, un système de solvant avec du chloroforme, le méthanol, l'acide acétique et de l'eau (85: 20: 10: 4, v / v / v / v) est utilisé ^13. Parfois deux dimensions TLC en utilisant deux différents systèmes de solvants est effectué pour d'autres glycolipides et des phospholipides séparés ^19. En outre, les tissus de la plante peuvent être directement soumis à la réaction suivie par GLC FAME pour déterminer le profil des acides gras totaux sans séparation initiale sur TLC ^5. A côté de la CCM ont démontré GLC-système, une autre méthode utilisée pour le profilage des lipides est basé sur la masse d'ionisation électrospray directe tandem de spectrométrie ^17. Dans cette méthode, la séparation chromatographique initiale de lipides dans l'extrait est omise. Cependant, cette méthode nécessite un équipement coûteux et un personnel expérimenté, ce qui rend moins utile pour des analyses de routine en laboratoire ou pour le dépistage mutant.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
α-naphthol	Sigma-Aldrich	N1000
Methanolic HCL 3N	Sigma-Aldrich	33050-U	Dilute to 1N by methanol
Si250-PA TLC plates	JT Baker	7003-04	With pre-absorbent
TLC chamber	Sigma-Aldrich	Z266000
Screw cap tubes	VWR international	53283-800
Scew caps	Sun Sri	13-425
PTFE disk	Sun Sri	200 608
GLC system	Hewlett-Packard	HP6890
DB-23 column	J&W Scientific	122-2332
GLC vials	Sun Sri	500 132
Caps of GLC vials	Sun Sri	201 828
Chemstation software	Agilent Technologies	G2070AA