Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling durch Dünnschichtchromatographie (TLC) mit Gas-Flüssigkeits-Chromatographie (GLC) Coupled

Zusammenfassung

Zusammensetzung der polaren Lipid-Extrakte und der Fettsäure-Zusammensetzung der einzelnen Glycerolipide sind in einem einfachen und robusten Lipid-Profiling Experiment bestimmt. Zu diesem Zweck sind Glycerolipide durch Dünnschicht-Chromatographie isoliert und Transmethylierung ihrer Acylgruppen. Fatty Acyl Methylester durch Gas-Flüssigkeits-Chromatographie quantifiziert.

Zusammenfassung

Biologische Membranen einzelner Zellen aus der Umwelt. Aus einer einzigen Zelle zu vielzelligen Pflanzen und Tieren, Glycerolipide, wie Phosphatidylcholin oder Phosphatidylethanolamin, Form-Doppelschicht-Membranen, die sowohl als Grenzen und Schnittstellen für die chemische Austausch zwischen Zellen und ihrer Umgebung zu handeln. Im Gegensatz zu Tieren haben Pflanzenzellen eine spezielle Organellen für die Photosynthese, die Chloroplasten. Die komplizierte Membransystem der Chloroplasten enthält einzigartige Glycerolipide, nämlich Glykolipide fehlt Phosphor: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), Digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) ^4. Die Rolle dieser Lipide sind über die reine strukturelle. Diese Glykolipide und andere Glycerolipide wurden in den Kristallstrukturen von Photosystem I und II mit den Engagements von Glycerolipiden bei der Photosynthese ^8,11 gefunden. Während Phosphat Hunger, ist DGDG zu extraplastidic Membranen übertragen, um den Verlust von Phospholipiden ^9,12 kompensieren.

Viel von unserem Wissen über die Biosynthese und Funktion dieser Lipide wurde aus einer Kombination von genetischen und biochemischen Studien mit Arabidopsis thaliana ^{14 geschlossen} wurde abgeleitet. Während dieser Studien wurde ein einfaches Verfahren für die Analyse von polaren Lipiden wurden für das Screening und Analyse von Lipid-Mutanten wesentlich und werden im Detail erläutert werden. Ein Blatt Lipidextrakt wird zunächst durch Dünnschichtchromatographie (TLC) getrennt und Glycerolipide sind reversibel mit Joddampf gefärbt. Die einzelnen Lipide werden aus der DC-Platte abgekratzt und konvertierte zum Fettacyl Methylester (FAME), die durch Gas-Flüssigkeits-Chromatographie mit Flammenionisationsdetektor (FID-GLC) (Abbildung 1) gekoppelt analysiert werden. Diese Methode hat sich bewährt, um eine zuverlässige Werkzeug für Mutanten-Screening werden. Zum Beispiel die tgd1, 2,3,4 endoplasmatischen Retikulum-to-Plastiden Lipid Handels-Mutanten wurden auf Basis der Akkumulation von einer anormalen galactoglycerolipid entdeckt: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) und eine Abnahme in der relativen Menge von 18:3 (Kohlen: Doppel- Anleihen) Fettacylgruppen in Membranlipiden ^3,13,18,20. Diese Methode ist auch anwendbar für die Bestimmung enzymatischer Aktivitäten von Proteinen unter Verwendung von Lipiden als Substrat ^6.

Protokoll

1. Lipidextraktion

1. Begin Lipidextraktion durch die Ernte 30 mg 4-Wochen alten Arabidopsis Blättern von Pflanzen auf Agar verfestigtem Medium oder Boden und überführen sie in 1,5 ml Polypropylen Reaktionsrohre. Frische Blätter können in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C.
2. Geben Sie 300 ul Extraktionsmittel Methanol zusammen, Chloroform und Ameisensäure (20.10.01, v / v / v) zu jeder Probe. Kräftig schütteln (mit einem Farbschüttler oder ähnliches) für 5 Minuten.
3. Fügen Sie 150 ul 0,2 M Phosphorsäure (H ₃ PO _4), 1 M Kaliumchlorid (KCl) und kurz vortexen.
4. Zentrifuge bei 13.000 xg bei Raumtemperatur für 1 Minute. Lipide in der unteren Chloroformphase aufgelöst wird auf DC-Platten entdeckt werden.

2. Dünnschicht-Chromatographie (TLC) ¹⁵

1. Zur Vorbereitung DC-Platten, vorgeschla-20cmx20cm Kieselgels DC-Platte mit dem Laden Streifen für 30 sec in 0,15 M Ammoniumsulfat ((NH _{4) 2} SO _4)-Lösung, nach dem Untertauchen für 30 Sekunden, trocknen Sie die Platte für mindestens 2 Tage in einem abgedeckten Behälter. Während der Aktivierung der Sublimation von Ammonium hinterlässt Schwefelsäure, die Phosphatidylglycerin, die für ihre Trennung von anderen Glycerolipide protoniert.
2. Am Tag des Experiments, TLC aktivieren Platten durch Backen im Ofen bei 120 ° C für 2,5 Stunden.
3. Nach dem Abkühlen der aktivierten Platten auf Raumtemperatur, mit einem Bleistift eine gerade Linie (1,5 cm vom Rand der Platte) über die Platte ziehen am Ursprung des Chromatogramms.
4. In einem Abzug langsam liefern 3 X 20 ul der Lipid-Extrakt in der unteren Chloroformphase mit einer 20 ul Pipette mit 200 ul gelbem Kunststoff Tipps unter einem langsamen Strom von N _2. Zu diesem Zweck ist ein Tygon Schlauch an den Regler des N ₂ Tank verbunden. Halten Sie die Stelle kleiner als 1 cm im Durchmesser. Jede Platte kann bis zu 10 Proben (wenn nachfolgende GLC-Analyse geplant ist).
5. Da die Lipid-spots ganz trocken in der Abzugshaube, bereiten den Entwicklungsländern Lösungsmittel Aceton, Toluol, Wasser (91 mL: 30 mL: 7,5 mL) zusammen. Wenn die Umgebungstemperatur relative Luftfeuchtigkeit ist hoch, könnte Trennung betroffen sein. In diesem Fall Wasser sollte reduziert (91 mL: 30 mL: 7,0 mL) geben werden, um die gewünschte Trennung zu erreichen.
6. Gießen Sie 80 mL der Entwicklung in eine verschließbare TLC Entwicklung Kammer (L: H: W = 27,0: 26,5: 7,0, cm / cm / cm) Lösungsmittel und legen Sie die Platte in den Tank mit der Probe Ende nach unten zeigt. Seal den Tank mit der Klemme. Das Lösungsmittel wird wieder aufsteigen der Platte und Lipiden getrennt werden. Die Entwicklungszeit beträgt etwa 50 Minuten bei Raumtemperatur.
7. Wenn das Lösungsmittel vor hat 1 cm vom oberen Rand der Platte erreicht, entfernen Sie vorsichtig die Platte aus dem Tank und vollständig trocknen in den Abzug, der für etwa 10 Minuten.
8. Lipide durch TLC getrennt werden kann entweder reversibel kurz mit Jod für eine quantitative Analyse oder irreversibel gefärbt mit Schwefelsäure oder α-Naphthol gefärbt.
   1. Schwefelsäure Verkohlung: Sprühen Sie den Teller mit 50% iger Schwefelsäure in Wasser in einem Glas-Sprühflasche in der Abzugshaube und backen bei 120 ° C für 15 Minuten (Abbildung 2A).
   2. α-Naphthol Färbung für Glykolipide: Sprühen Sie den Teller mit 2,4% (w / v) α-Naphthol in 10% (v / v) Schwefelsäure, 80% (v / v) Ethanol und backen bei 120 ° C für 3-5 Minuten, bis Glycolipid Bands gefärbt rosa oder violett (Abbildung 2B). Übertherapie wird aller Lipide aufgrund des Vorhandenseins von Schwefelsäure im Reagenz Verkohlung führen.
   3. Iodfärbung: in einer Abzugshaube wird die Platte in einen geschlossenen Behälter mit TLC Iodkristalle (in einem Fach auf der Unterseite führen zur Sättigung der Atmosphäre mit Joddampf bis Lipide sichtbar sind). Setzen Sie die Platte an Jod zu lange Jod kann kovalent modifizieren mehrfach ungesättigten Fettsäuren (Abbildung 2C). Alternativ zu vermeiden Oxidation von Lipiden, nur Standard-Spuren mit Proben Spuren durchsetzt gebeizt sollte mit einem Glaswolle gesteckt Pasteurpipette mit Jod Kristalle, durch die N ₂ über einzelne Standard-Bahnen geblasen wird.

3. Fatty Acyl Methylester (FAME) Reaktion ¹⁶

1. Entfernen Kieselsäure Umgebung identifiziert Lipid-Spots aus der DC-Platte mit einer Rasierklinge. Kratzen Sie die Lipid-Gehalt an Kieselsäure und übertragen Sie die Silica-Pulver mit einem Trichter in ein Glasrohr mit einem Teflon (PTFE)-gesäumten Schraubverschluss.
2. 1 ml 1 N Salzsäure (HCl) in wasserfreiem Methanol zu jeder Probe durch Glaspipette.
3. Geben Sie 100 ul 50 ug mL ^-1 Pentadecansäure (15:0) mit 200 ul Pipette zu jeder Probe als interner Standard mit einem 200-ul-Pipette mit 200 ul gelbe Spitze aus Kunststoff. Halten Sie ein Rohr mit nur pentadecenoic Säure in methanolischer HCl als Kontrolle. Close Glasröhren dicht mit Teflon ausgekleideten Kappen.
4. Inkubieren glass Röhrchen in einem 80 ° C Wasserbad für 25 Minuten. Tubes müssen abgedichtet werden, so dass das Lösungsmittel nicht verdampft.
5. Nach Rohre abgekühlt haben, fügen Sie 1 mL 0,9% Natriumchlorid mit 1 mL Hexan und kräftig vortexen gefolgt. Centrifuge Proben bei 1000xg für 3 Minuten.
6. In der Abzugshaube, entfernen Sie die Hexan / obere Schicht der Probe mit Pasteurpipette und legen Sie sie in eine neue 13x100 mm Glasrohr.
7. Dampft Hexan unter einem langsamen Strom von N ₂ ohne Trocknung vollständig.
8. Lösen Sie die resultierende Fettacyl Methylester s in 60 ul Hexan. Transfer-Proben in Autosampler-Vials und fest verschließen. Die Proben können bei 4 ° C für die kurzfristige und -20 ° C für ein paar Tage gelagert werden.

4. Gas-Flüssigkeits-Chromatographie (GLC) ¹⁰

1. Vor Beginn der GLC, sicher, dass das Helium, Wasserstoff und Luft Flaschen gefüllt werden.
2. Ausreichende Hexan müssen, um das Lösungsmittel-Reservoir aufgenommen werden und die Abfallbehälter müssen leer sein. Für Fettacyl Methylester Trennung, fügen Sie eine DB-23 Säule an der Maschine.
3. Legen Flaschen in den Autosampler. Starten Sie den Chemstation Software für GLC auf dem System Computer.
4. Stellen Sie die Vorlauftemperatur bei 250 ° C mit Helium Durchfluss mit 48,6 mL min ^-1 und der Druck bei 21,93 psi. Das Teilungsverhältnis beträgt 30,0: 1.
5. Die Ofentemperatur wird zunächst bei 140 ° C für 2 min eingestellt und raiste auf 160 ° C mit einer Rate von 25 ° C min ^-1. Dann die Temperatur auf 160 ° C ansteigen zu 250 ° C mit einer Rate von 8 ° C min ^-1 und halten bei 250 ° C für 4 min durch einen Rückgang um 140 ° C mit einer Rate von 38 ° C min ^{- 1.} Ein Run dauert ca. 21 Minuten.
6. Die Temperatur der Flammenionisationsdetektor ist 270 ° C mit einem Wasserstoff-Volumenstrom von 30,0 mL min ^-1, Luftdurchsatz von 400 mL min ^-1 und Helium Durchfluss bei 30,0 mL min ^-1.
7. Geben Sie die Anzahl der Fläschchen und Probe Namen in der Ablaufreihenfolge Tisch. Stellen Sie die 10 l Injektor zu 2 ul Probe pro Flasche zu injizieren.
8. Wenn das Instrument fertig ist, starten Sie die Ablaufreihenfolge.

5. Repräsentative Ergebnisse:

Beispiele für irreversible Verfärbung der TLC-Trennung Lipide aus 4-Wochen alten Arabidopsis-Keimlinge sind in Abbildung 2 dargestellt. Die Schwefelsäure gebeizt Lipiden (Abbildung 2A) sind verkohlt und erscheinen als braune Flecken. α-Naphthol wird bevorzugt, Glycolipide wie MGDG Fleck, DGDG, SQDG etc. Glycolipide mit α-Naphthol tragen eine rosa-lila Farbe, während andere polare Lipide Fleck gelb (Abbildung 2B) gefärbt. Das Jod-Färbung ist reversibel und ermöglicht Lipide eine gelbliche Farbe, die über einen kurzen Zeitraum wie Jod verdunstet (Abbildung 2C) verschwinden. Kurz Jod gefärbt Lipide können zur GLC-Analyse unterzogen werden, obwohl ungefärbten Lipide vorzuziehen reduzieren Abbau von Lipiden sind.

Wenn dies geschehen ist erfolgreich, wird markante Signale, die verschiedene Fatty Acyl-Methylester nach GLC beobachtet werden (Abbildung 3). Fatty Acyl-Methylester mit kürzeren Kohlenstoffkette und weniger Doppelbindungen haben kürzere Verweildauer mit dem DB-23 Säule. Fatty Acyl-Methylester-Profiling ist ein empfindliches Werkzeug, um Mutanten mit veränderten Lipid-Zusammensetzung zu identifizieren. In Abbildung 4, die MGDG18: ist 3-Fettsäure-Molverhältnis in der tgd4-1-Mutante im Vergleich zum Wildtyp-Typ ¹⁸ verringert. Durch die Aufteilung der Mole von Fatty Acyl-Methylester für eine Lipid-Klasse mit der Mole aller Lipidklassen sind das Molverhältnis von jedem Lipid berechnet. Zum Beispiel, um das Molverhältnis von MGDG berechnen:

(MGDG) mol% = Σ [FAME _(MGDG)] / Σ [FAME _(gesamt)] x100%

Die daraus resultierenden Molverhältnisse der einzelnen Lipid-Klasse sowohl aus dem Wildtyp und der Mutante verglichen werden kann. Zum Beispiel hat die tgd4-1 Mutante relativen Mengen von MGDG und PG erhöht, sondern verringert Mengen DGDG und PE (Abbildung 5) ^18.

Abbildung 1. Flussdiagramm der polaren Lipid-Analyse unter Verwendung von Arabidopsis-Keimlinge. Insgesamt Lipide sind aus 4-Wochen alten Arabidopsis-Keimlinge entnommen und getrennt durch TLC. Die getrennten Lipide können von DC-Platte für die Umesterung durch GLC-Analyse gefolgt abgekratzt werden.

Abbildung 2. Trennung von Lipiden auf DC-Platten. Lipid-Extrakte von 35 mg (Frischgewicht) Wildtyp-Keimlingen sind durch TLC getrennt und gefärbt durch Schwefelsäure (A), α-Naphthol (B) oder Joddampf (C). Drei Wiederholungen sind in jeder Färbemethode gezeigt. DGDG, Digalactosyldiacylglycerol; MGDG, monogalactosyldiacylglycerol; PC, Phosphatidylcholin, PE, Phosphatidylethanolamin, PG, phosphatidylglycerol; PI, Phosphatidylinositol; SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol.

Abbildung 3. GLC-Analyse von Fettsäure-Methylester (FAME) aus MGDG des Wildtyp abgeleitet. FAME sind auf einer 30 m Kapillarsäule aufgetrennt und durch Flammenionisationsdetektor. Pentadecansäure (15:0) wird als interner Standard verwendet.

Abbildung 4. Fettsäure-Profil MGDG im Wildtyp Col2 (weiße Säulen) und die tgd4-1-Mutante (schwarze Säulen). Fettsäuren sind als die Anzahl der Kohlenstoffatome durch die Anzahl der Doppelbindungen, gefolgt vorgestellt. Drei Wiederholungen gemittelt und Standardabweichungen dargestellt.

Abbildung 5. Polar Lipide Zusammensetzung des Wildtyp Col2 (weiße Säulen) und die tgd4-1-Mutante (schwarze Säulen). Drei Wiederholungen gemittelt und Standardabweichungen sind durch Fehlerbalken dargestellt.

Diskussion

TLC gekoppelt mit GLC bietet eine robuste und schnelle Werkzeug für die quantitative Analyse von polaren Lipiden in Pflanzen. Kleine Veränderungen in Lipid-Zusammensetzung identifiziert werden können, daher hat diese Methode für große Screening von Mutanten in polaren Lipid-Stoffwechsel ^1,20 beeinträchtigt worden. Diese Methode wird auch häufig für die Überwachung der Aktivitäten der Enzyme nutzen polaren Lipiden als Substrat verwendet. ^2,6,7

Neben verlässt, kann die Lipid-Zusammensetzung von anderen pflanzlichen Geweben wie Wurzeln und Samen oder subzellulären Fraktionen wie Chloroplasten und Mitochondrien auch in der gleichen Weise bestimmt werden.

Das Lösungsmittel-System (Aceton, Toluol, Wasser) ist hier für die Trennung von Glycolipiden und Phospholipiden in Pflanzen optimiert. Doch in tgd1, 2,3,4-Mutanten und isolierten Chloroplasten läuft TGDG zusammen mit PE während tetragalactosyldiacylglycerol läuft mit PC. In diesem Fall wird ein Lösungsmittel mit Chloroform, Methanol, Essigsäure und Wasser (85: 20: 10: 4, v / v / v / v) wird ¹³ verwendet. Manchmal zweidimensionale TLC mit zwei verschiedenen Lösungsmittel-Systeme ist es, weitere separate Glycolipide und Phospholipide ¹⁹ durchgeführt. Darüber hinaus können pflanzliche Gewebe direkt auf die FAME Reaktion durch GLC gefolgt, um den gesamten Fettsäuregehalt Profil ohne anfängliche Trennung auf TLC ^{5 zu} bestimmen unterzogen werden. Neben dem Beweis TLC-GLC System, ist eine weitere Methode für die Lipid-Profile genutzt, auf direktem Elektrospray-Tandem-Massenspektrometrie ^{17 beruht.} Bei dieser Methode wird die erste chromatographische Trennung von Lipiden in der Extrakt wird weggelassen. Allerdings erfordert diese Methode teure Ausrüstung und erfahrenes Personal, das es weniger nützlich für Routine-Analysen im Labor oder für Mutanten-Screening macht.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
α-naphthol	Sigma-Aldrich	N1000
Methanolic HCL 3N	Sigma-Aldrich	33050-U	Dilute to 1N by methanol
Si250-PA TLC plates	JT Baker	7003-04	With pre-absorbent
TLC chamber	Sigma-Aldrich	Z266000
Screw cap tubes	VWR international	53283-800
Scew caps	Sun Sri	13-425
PTFE disk	Sun Sri	200 608
GLC system	Hewlett-Packard	HP6890
DB-23 column	J&W Scientific	122-2332
GLC vials	Sun Sri	500 132
Caps of GLC vials	Sun Sri	201 828
Chemstation software	Agilent Technologies	G2070AA