Arabidopsis thaliana Profiling Glycerolipid Polar Cromatografia su strato sottile (TLC) Accoppiato con cromatografia gas-liquido (GLC)

Riepilogo

Composizione di estratti dei lipidi polari e la composizione in acidi grassi di glycerolipids individuali sono determinati in un esperimento lipidi semplice e robusto profilo. A tal fine, glycerolipids sono isolati per cromatografia su strato sottile e sottoposti a transmetilazione dei loro gruppi acilici. Grassi methylesters acil sono quantificati da gas-cromatografia in fase liquida.

Abstract

Membrane biologiche delle cellule separato dall'ambiente. Da una singola cellula per le piante e gli animali pluricellulari, glycerolipids, come fosfatidilcolina o fosfatidiletanolamina, membrane a doppio strato forma che fungono da entrambi i confini e interfacce per lo scambio chimico tra le cellule e l'ambiente circostante. A differenza degli animali, cellule vegetali hanno un organello speciale per la fotosintesi, il cloroplasto. Il sistema a membrana intricato del cloroplasto contiene glycerolipids unico, vale a dire glicolipidi carente di fosforo: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (dgdg), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) ^4. I ruoli di questi lipidi sono oltre la semplice strutturali. Queste glicolipidi e glycerolipids altri sono stati trovati nelle strutture cristalline di fotosistema I e II che indicano il coinvolgimento di glycerolipids nella fotosintesi ^8,11. Durante il digiuno fosfato, dgdg è trasferito alle membrane extraplastidic per compensare la perdita di fosfolipidi ^9,12.

Gran parte della nostra conoscenza della biosintesi e funzione di questi lipidi è stata tratta da una combinazione di studi genetici e biochimici con ¹⁴ Arabidopsis thaliana. Durante questi studi, una procedura semplice per l'analisi dei lipidi polari è stato essenziale per lo screening e analisi di mutanti lipidi e saranno descritte in dettaglio. Un estratto lipidico foglia è prima separate da cromatografia su strato sottile (TLC) e glycerolipids sono macchiati reversibilmente con vapori di iodio. I lipidi individuali sono raschiati dalla piastra TLC e convertito in grasso methylesters acil (FAME), che vengono analizzati dal gas-cromatografia liquida accoppiata con rilevazione a ionizzazione di fiamma (FID-GLC) (Figura 1). Questo metodo ha dimostrato di essere uno strumento affidabile per lo screening dei mutanti. Ad esempio, il tgd1, 2,3,4 reticolo endoplasmatico-to-plastidiale mutanti traffico di lipidi sono stati scoperti in base all'accumulo di un galactoglycerolipid anormale: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) e una diminuzione della quantità relativa di 18:3 (carboni: doppio obbligazioni) grassi gruppi acil in lipidi di membrana ^3,13,18,20. Questo metodo è applicabile anche per determinare le attività enzimatiche di proteine ​​con lipidi come substrato ^6.

Protocollo

1. Estrazione dei lipidi

1. Iniziare l'estrazione dei lipidi dalla raccolta di 30 mg di 4 settimane di età lascia Arabidopsis da piante coltivate su agar solidificato media o suolo e trasferirli in provette da 1,5 ml in polipropilene reazione. Foglie fresche possono essere istantaneamente congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C.
2. Aggiungere 300 microlitri di estrazione solvente composto da metanolo, cloroformio e acido formico (20:10:01, v / v / v) per ogni campione. Agitare vigorosamente (utilizzando una vernice shaker o simili) per 5 minuti.
3. Aggiungere 150 ml di acido fosforico 0,2 M (H ₃ PO _4), 1 M di cloruro di potassio (KCl) e mescolare brevemente nel vortex.
4. Centrifugare a 13.000 xg a temperatura ambiente per 1 minuto. Lipidi sciolte nella fase cloroformio minore sarà individuato su piastre TLC.

2. Cromatografia su strato sottile (TLC) ¹⁵

1. Per preparare piatti TLC, immergere uno 20cmx20cm gel di silice rivestito con lastrina di caricamento striscia per 30 sec in 0,15 M di solfato di ammonio ((NH _{4) 2} SO ₄₎ soluzione, dopo immergendo per 30 secondi, asciugare la piastra per almeno 2 giorni un recipiente coperto. Durante l'attivazione la sublimazione di ammonio lascia dietro di acido solforico, che protonates fosfatidilglicerolo necessarie per la sua separazione da glycerolipids altri.
2. Il giorno della sperimentazione, attivare TLC piastre di cottura in forno a 120 ° C per 2,5 ore.
3. Dopo il raffreddamento le piastre attivato a temperatura ambiente, usare una matita per disegnare una linea retta (1,5 cm dal bordo del piatto) attraverso la piastra all'origine del cromatogramma.
4. In una cappa aspirante, lentamente consegnare 3 X 20 l di estratto lipidico in fase di cloroformio inferiore utilizzando una pipetta 20 microlitri con 200 ul punte di plastica gialla sotto una debole corrente di N _2. A tal fine, un tubo Tygon è collegata al regolatore del serbatoio ₂ N. Mantenere il posto più piccolo di 1 cm di diametro. Ogni piatto può contenere fino a 10 campioni (quando successiva analisi GLC è prevista).
5. Come lipidi punti completamente asciutto nella cappa, preparare il solvente di sviluppo composto da acetone, toluene, acqua (91 ml: 30 ml: 7,5 ml). Se l'umidità relativa dell'aria è alta, la separazione potrebbe essere danneggiato. In questo caso l'acqua deve essere ridotta a dare (91 ml: 30 ml: 7,0 mL) per ottenere la separazione desiderata.
6. Versare 80 ml solvente di sviluppo in un TLC sigillabile camera di sviluppo (L: H: W = 27,0: 26,5: 7,0 cm / cm / cm) e posizionare la lastra nella vasca con l'estremità del campione verso il basso. Tenuta del serbatoio con il morsetto. Il solvente salirà il piatto e lipidi saranno separati. Il tempo di sviluppo è di circa 50 minuti a temperatura ambiente.
7. Quando il fronte del solvente ha raggiunto 1 cm dal bordo superiore della piastra, rimuovere con cautela la piastra dal serbatoio e asciugare completamente nella cappa per circa 10 minuti.
8. Lipidi separati da TLC può essere reversibile macchiato brevemente con iodio per l'analisi quantitativa o irrimediabilmente macchiata con acido solforico o α-naftolo.
   1. Carbonizzazione acido solforico: spruzzare il piatto con il 50% di acido solforico in acqua in una bottiglia di vetro a spruzzo nella cappa e cuocere in forno a 120 ° C per 15 minuti (Figura 2A).
   2. α-naftolo colorazione per glicolipidi: spruzzare il piatto con del 2,4% (w / v) α-naftolo nel 10% (v / v) di acido solforico, 80% (v / v) di etanolo e cuocere in forno a 120 ° C per 3-5 minuti fino a quando le bande glicolipidi sono macchiati rosa o viola (Figura 2B). Trattamento eccessivo porterà alla carbonizzazione di tutti i lipidi a causa della presenza di acido solforico nel reagente.
   3. Colorazione di iodio: in una cappa aspirante, la piastra in una vasca TLC chiuso con cristalli di iodio (in un vassoio sul fondo portando alla saturazione dell'atmosfera con vapori di iodio fino a quando i lipidi sono visibili). Non esporre la piastra di iodio troppo lungo lo iodio può modificare covalentemente acidi grassi polinsaturi (Figura 2C). In alternativa, per evitare l'ossidazione dei lipidi, solo piste di serie intervallate da corsie campione deve essere colorato con una lana di vetro collegato pipetta Pasteur con cristalli di iodio attraverso la quale viene soffiata N ₂ su singole corsie standard.

3. Grassi Acil metilestere (FAME) di reazione ¹⁶

1. Rimuovere macchie di silice circostanti lipidi identificato dalla piastra TLC con una lametta. Raschiare la silice che contiene lipidi e trasferire la polvere di silice usando un imbuto in un tubo di vetro con un (PTFE)-tappo a vite rivestiti in Teflon.
2. Aggiungere 1 ml 1 N di acido cloridrico (HCl) in metanolo anidro di ogni campione con pipetta di vetro.
3. Aggiungere 100 ul 50 mg ml ^-1 pentadecanoic acido (15:00) con 200 microlitri pipetta ad ogni campione come standard interno con una pipetta 200 microlitri punta con 200 microlitri di plastica gialla. Mantenere un tubo con solo acido pentadecenoic in metanolica HCl come controllo. Chiudere ermeticamente con tubi di vetro rivestita di teflon tappi.
4. Incubare gltubi culo in un bagno d'acqua 80 ° C per 25 minuti. Tubi devono essere sigillati in modo che il solvente non evapori.
5. Dopo che i tubi si sono raffreddati, aggiungere 1 ml di sodio cloruro 0,9% seguito da 1 ml di esano e vortice vigorosamente. Centrifugare i campioni a 1000xg per 3 minuti.
6. Nella cappa, rimuovere lo strato esano / superiore del campione con pipetta Pasteur e collocarlo in un nuovo tubo di vetro 13x100 millimetri.
7. Far evaporare esano sotto una debole corrente di N ₂ senza seccare completamente.
8. Sciogliere il grasso risultante acil methylesters s in 60 microlitri esano. Trasferimento dei campioni in fiale autocampionatore e tappo. I campioni possono essere conservati a 4 ° C per breve termine e -20 ° C per pochi giorni.

4. Gascromatografia (GLC) ¹⁰

1. Prima di iniziare GLC, Assicurarsi che l'elio, idrogeno e cilindri ad aria sono riempiti.
2. Esano sufficiente deve essere aggiunto al serbatoio del solvente ed il contenitore dei rifiuti deve essere vuoto. Per i grassi separazione acil methylesters, allegare un DB-23 colonna alla macchina.
3. Fiale posto nel campionatore automatico. Avviare il software Chemstation per GLC sul computer sistema.
4. Impostare la temperatura di ingresso a 250 ° C con una portata di elio a 48,6 ml min ^-1 e la pressione a 21,93 psi. Il rapporto di divisione è 30,0: 1.
5. La temperatura del forno è impostato inizialmente a 140 ° C per 2 minuti e cresciuto a 160 ° C ad una velocità di 25 ° C min ^-1. Quindi impostare la temperatura aumenterà da 160 ° C a 250 ° C ad una velocità di 8 ° C min ^-1 e tenere a 250 ° C per 4 minuti seguita da una diminuzione a 140 ° C ad una velocità di 38 ° C min ^{- 1.} Una corsa dura circa 21 minuti.
6. La temperatura del rivelatore a ionizzazione di fiamma è di 270 ° C con un tasso di idrogeno flusso di 30,0 ml min ^-1, portata d'aria a 400 ml min ^-1 e la portata di elio al 30,0 ml min ^-1.
7. Inserire il numero di fiale e nomi di esempio nella tabella sequenza di esecuzione. Impostare il 10 L iniettore per iniettare un campione di 2 microlitri per flaconcino.
8. Quando lo strumento è pronto, iniziare la sequenza di esecuzione.

5. Rappresentante dei risultati:

Esempi di colorazione irreversibile di TLC separati da lipidi da 4 settimane di età piantine di Arabidopsis sono mostrati nella Figura 2. I lipidi acido solforico colorato (Figura 2A) sono carbonizzati e appaiono come macchie scure. α-naftolo è preferito a macchia glicolipidi come MGDG, dgdg, SQDG glicolipidi ecc colorati con α-naftolo portare una rosa-viola, mentre gli altri lipidi polari macchia gialla (Figura 2B). La colorazione di iodio è reversibile e dà lipidi un colore giallastro che scompare in un tempo breve evapora iodio (Figura 2C). Lipidi iodio brevemente macchiato può essere sottoposto ad analisi GLC lipidi senza macchia, anche se sono preferibili per ridurre abbattere dei lipidi.

Se fatto con successo, segnali distintivi che rappresentano differenti grassi acil metilico saranno osservati dopo GLC (Figura 3). Grassi metilico acilici con catena di carbonio più brevi e meno doppi legami hanno tempo di permanenza più brevi con la batteria DB-23 colonna. Grassi acil profiling metilico è uno strumento sensibile per identificare i mutanti con alterata composizione lipidica. Nella Figura 4, il MGDG18: 3 rapporto di acidi grassi molare è diminuito nel tgd4-1 mutante rispetto al wild-type ^18. Dividendo il moli di grassi acil metilico per una classe di lipidi con le moli di tutte le classi di lipidi, il rapporto molare di ogni lipidi vengono calcolati. Ad esempio, per calcolare il rapporto molare di MGDG:

(MGDG)% mol = Σ [FAME _(MGDG)] / Σ [FAME _(totale)] x100%

I rapporti conseguenti molare di ogni classe dei lipidi sia dal tipo selvaggio e il mutante può essere paragonato. Per esempio, il tgd4-1 mutante è aumentata quantità relative di MGDG e PG, ma è diminuito quantità di dgdg e PE (Figura 5) ^18.

Figura 1. Diagramma di flusso di analisi dei lipidi polari utilizzando piantine di Arabidopsis. Lipidi totali sono estratti da 4 settimane di età piantine di Arabidopsis e separati da TLC. I lipidi separato può essere grattata da lastrina per transesterificazione seguita da analisi GLC.

Figura 2. Separazione dei lipidi su lastre TLC. Estratti lipidici di 35 mg (peso vivo) piantine di tipo selvatico sono separati da TLC e macchiato da acido solforico (A), α-naftolo (B) o vapori di iodio (C). Tre ripetizioni sono indicati in ogni metodo di colorazione. Dgdg, digalactosyldiacylglycerol; MGDG, monogalactosyldiacylglycerol, PC, fosfatidilcolina, PE, fosfatidiletanolamina, PG, phosphatidylglycerol, PI, fosfatidilinositolo, SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol.

Figura 3. Analisi GLC della Methylesters acidi grassi (FAME) derivato dal MGDG del tipo selvatico. FAMEs sono separati su una colonna di 30 m capillare e rilevati da ionizzazione di fiamma. Pentadecanoic acido (15:00) è utilizzato come standard interno.

Figura 4. Profilo degli acidi grassi di MGDG nel tipo selvatico Col2 (colonne bianche) e la tgd4-1 mutante (colonne nere). Gli acidi grassi sono presentati come numero di atomi di carbonio, seguito dal numero di doppi legami. Tre ripetizioni viene calcolata la media e le deviazioni standard sono mostrati.

Figura 5. Polare composizione dei lipidi del tipo selvatico Col2 (colonne bianche) e la tgd4-1 mutante (colonne nere). Tre ripetizioni viene calcolata la media e le deviazioni standard sono indicate dalle barre di errore.

Discussione

TLC accoppiato con GLC fornisce uno strumento robusto e rapido per l'analisi quantitativa dei lipidi polari nelle piante. Piccoli cambiamenti nella composizione lipidica possono essere identificati, quindi, questo metodo è stato utilizzato per lo screening su larga scala di mutanti ridotta nei percorsi metabolici dei lipidi polari ^1,20. Questo metodo è anche ampiamente utilizzato per attività di monitoraggio degli enzimi che utilizzano lipidi polari come substrato. ^2,6,7

Oltre a foglie, la composizione lipidica di altri tessuti vegetali come radici e semi o frazioni subcellulari come i cloroplasti e mitocondri può essere determinata anche nello stesso modo.

Il sistema di solventi (acetone, toluene, acqua) usato qui è ottimizzato per la separazione di glicolipidi e fosfolipidi nelle piante. Tuttavia, in tgd1, 2,3,4 mutanti e cloroplasti isolati, TGDG corre insieme al PE, mentre tetragalactosyldiacylglycerol funziona con PC. In questo caso un sistema di solvente con cloroformio, metanolo, acido acetico e acqua (85: 20: 10: 4, v / v / v / v) viene utilizzato ^13. A volte bidimensionale TLC utilizzando due diversi sistemi solvente viene eseguita per separare ulteriormente glicolipidi e fosfolipidi ^19. Inoltre, tessuti vegetali possono essere direttamente sottoposte alla reazione FAME seguito da GLC per determinare il profilo totale di acidi grassi, senza separazione iniziale sul TLC ^5. Accanto alla TLC-GLC dimostrato sistema, un altro metodo utilizzato per la profilazione dei lipidi si basa sulla diretta di massa a ionizzazione electrospray tandem spettrometria di ^17. In questo metodo la separazione cromatografica iniziale dei lipidi nel estratto è omesso. Tuttavia, questo metodo richiede apparecchiature costose e personale esperto, che lo rende meno utile per analisi di routine in laboratorio o per lo screening mutante.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
α-naphthol	Sigma-Aldrich	N1000
Methanolic HCL 3N	Sigma-Aldrich	33050-U	Dilute to 1N by methanol
Si250-PA TLC plates	JT Baker	7003-04	With pre-absorbent
TLC chamber	Sigma-Aldrich	Z266000
Screw cap tubes	VWR international	53283-800
Scew caps	Sun Sri	13-425
PTFE disk	Sun Sri	200 608
GLC system	Hewlett-Packard	HP6890
DB-23 column	J&W Scientific	122-2332
GLC vials	Sun Sri	500 132
Caps of GLC vials	Sun Sri	201 828
Chemstation software	Agilent Technologies	G2070AA