気-液クロマトグラフィー（GLC）とあいまって薄層クロマトグラフィー（TLC）によりシロイヌナズナポーラーグリセロ脂質プロファイリング

要約

極性脂質抽出物の組成と個々のグリセロ脂質の脂肪酸組成は、シンプルで堅牢な脂質プロファイリング実験で決定されます。この目的のために、グリセロ脂質は薄層クロマトグラフィーによって分離されているとそのアシル基のメチル基移転を行った。脂肪酸アシルメチルエステルをガス - 液体クロマトグラフィーによって定量化されています。

要約

環境からの生物学的膜を別のセル。このようなホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミン、細胞とその周囲との間の化学交換のための両方の境界とのインタフェースとして機能するフォームの二分子膜として多細胞の植物や動物、グリセロ脂質、単一の細胞から。動物とは異なり、植物細胞は光合成のための特別な細胞小器官、葉緑体を持っている。 monogalactosyldiacylglycerol（MGDG）、digalactosyldiacylglycerol（DGDG）、スルホキノボシルジアシルグリセロール^{（SQDG）4：}葉緑体の複雑な膜システムは、すなわちユニークなグリセロ脂質、リンを欠く糖脂質が含まれています。これらの脂質の役割は、単に構造を超えています。これらの糖脂質と他のグリセロ脂質は光合成^8,11におけるグリセロ脂質の関与を示す光化学系IとIIの結晶構造で発見された。リン酸飢餓時には、DGDGは、リン脂質^9,12の損失を補うためにextraplastidic膜に転送されます。

多くのこれらの脂質の生合成と機能の我々の知る限りは、 シロイヌナズナの ¹⁴に遺伝学的および生化学的研究の組み合わせから導出されています。これらの調査の間に、極性脂質の分析のための簡単​​な手順では、脂質の変異体のスクリーニングと解析のために不可欠になっており、詳細に概説する。葉の脂質抽出物は、最初の薄層クロマトグラフィー（TLC）によって分離され、グリセロ脂質は、ヨウ素蒸気に可逆的に染色されています。個々の脂質は、TLCプレートから掻きと水素炎イオン化検出器（FID - GLC）（図1）と結合した気 - 液クロマトグラフィーによって分析されている脂肪酸アシルメチルエステル（のFAME）、に変換されます。このメソッドは、変異体スクリーニングのための信頼できるツールであることが証明されています。たとえば、tgd1、2,3,4小胞体からプラスチド脂質輸送変異体は、異常なgalactoglycerolipidの蓄積に基づいて発見されました。trigalactosyldiacylglycerol（TGDG）と18時03分の相対量の減少（炭素：ダブル債）膜脂質^3,13,18,20の脂肪酸アシル基。また、このメソッドは、基板⁶として脂質を用いてタンパク質の酵素活性を決定するための適用可能です。

プロトコル

1。脂質の抽出

1. 寒天培地上で生育した植物から30mgを4週齢のシロイヌナズナの葉を収穫によって脂質の抽出を開始する培地や土壌を固化し、1.5 mLのポリプロピレン反応チューブに移す。新鮮な葉は、フラッシュは、液体窒素中で凍結し、-80℃で保存することができます
2. 各サンプルにメタノールから成る溶剤300μL抽出、クロロホルムとギ酸（午前20時10分01秒、V / V / V）を追加します。 5分間（ペイントシェーカーまたは同様のを使用して）を激しく振る。
3. 0.2 Mリン酸（H ₃ PO _4）、1 M塩化カリウム（KCl）と渦簡単に150μLを加える。
4. 1分間、室温で13000 × gで遠心する。下のクロロホルム相に溶解した脂質は、TLCプレート上にスポットされます。

2。薄層クロマトグラフィー^（TLC）15

1. 水没0.15 Mの硫酸アンモニウム（（NH _4）2 SO _4）溶液中に30秒のためにストリップを読み込むと20cmx20cmシリカゲルコーティングTLCプレートを、TLCプレートを準備するには、30秒間水没した後、中に少なくとも2日間、プレートを乾燥させる対象となるコンテナ。アクティベーション中にアンモニウムの昇華は、他のグリセロ脂質からの分離のために必要なホスファチジルグリセロールをプロトン化硫酸、背後に残します。
2. 実験日に、アクティブには、120℃のオーブンで焼成することによりプレートをTLC 2.5時間° C。
3. 室温に活性化プレートを冷却した後、クロマトグラムの原点にプレートを介して直線（プレートの端から1.5 cm）を描画するために鉛筆を使用してください。
4. ドラフトでは、ゆっくりとN ₂の遅い流れの下、200μLの黄色いプラスチックのヒントと20μLピペットを使用して、より低いクロロホルム相の脂質抽出物の3 X 20μLを提供します。この目的のために、タイゴンチューブは、N ₂タンクのレギュレータに接続されている。直径1cm未満のスポットを保持します。各プレートは、10サンプル（その後のGLC分析が計画された時点）を保持することができます。
5. 脂質は、ドラフト内で完全に乾燥したスポットとして、アセトン、トルエン、水（30 mLを7.5 mLの91 mL）で構成される展開溶媒を準備。周囲の相対湿度が高い場合、分離に影響を及ぼす可能性があります。所望の分離を達成するためにこのケースでは水は（7.0 mLの：：30 mLの91 mL）を与えるために軽減する必要があります。
6. と下に向けて、サンプルの端にタンクにプレートを置く室（：H：W = 27.0：：26.5 7.0、CM / CM / CM L）を開発する密閉式TLCに展開溶媒80mlを注ぐ。クランプを使用してタンクを密閉する。溶剤は、プレートを登っれると脂質が分離されます。開発時間が室温で約50分です。
7. 溶剤フロントが板の上から1 cmに達したときに、慎重にタンクからプレートを取り外し、約10分間、ドラフト内で完全に乾かしてください。
8. TLCで分離された脂質は、いずれの可逆的定量分析のためにヨウ素で簡単に染色または不可逆的に硫酸またはα-ナフトールで染色することができます。
   1. 硫酸炭化：120ヒュームフードと焼くのスプレーガラスのスプレーボトルの水の50％硫酸でプレート℃で15分間（図2A）。
   2. 糖脂質のためのα-ナフトール染色：120 ° Cで2.4％（w / v）の10％のα-ナフトール（v / v）の硫酸、80％（v / v）エタノールと焼くとプレートをスプレー3-5糖脂質のバンドまでの分は、（図2B）、ピンクや紫色に染色される。過剰治療は、試薬中の硫酸の存在のためにすべての脂質の焦げにつながります。
   3. ヨウ素染色：ドラフト内で、ヨウ素の結晶を持つ閉じたTLCタンク（脂質が見えるようになるまでヨウ素蒸気を大気の飽和に至る下部にあるトレイの中）にプレートを置く。長すぎるヨウ素は、共有結合多価不飽和脂肪酸（図2C）を変更する可能性があるため、ヨウ素にプレートを公開しないでください。また、脂質のいずれかの酸化を避けるために、サンプルのレーンに混在のみ標準の車線は、ガラスウールを使用して染色されるべきであるN _2は、個々の標準車線以上の吹くに使用しているヨウ素の結晶をパスツールピペットを差し込ん。

3。脂肪酸アシルメチルエステル（FAME）反応¹⁶

1. かみそりの刃を持つTLCプレートから同定された脂質のスポットを囲むシリカを削除します。脂質含有シリカをこすり取ってテフロン（PTFE）ライニングスクリューキャップ付きガラス管に漏斗を用いてシリカ粉末を転送する。
2. ガラスピペットで各サンプルに無水メタノールで1mLの1N塩酸（HCl）を追加します。
3. 200μLの黄色いプラスチックチップで200μLピペットを用いて内部標準として、各サンプルに200μLピペットを用いて100μL50μgのmL ^-1のペンタデカン酸（15:0）を追加します。管コントロールとしてメタノール性塩酸でのみpentadecenoic酸としてください。テフロンライニングキャップでしっかりとガラス管を閉じます。
4. インキュベートGL25分間80℃の水浴中でお尻のチューブ。チューブは、溶媒が蒸発しないように密封する必要があります。
5. チューブが冷却した後、精力的に1mLのヘキサンと渦が続く1 mLの0.9％塩化ナトリウムを追加。 3分間1000xgでサンプルを遠心分離します。
6. ドラフトでは、パスツールピペットで試料のヘキサン/上位レイヤを削除し、新しい13x100 mmのガラス管に入れてください。
7. 完全に乾燥させることなく、N ₂の遅い流れの下でヘキサンを蒸発させる。
8. 60μLヘキサンで生じる脂肪酸アシルメチルエステルのを溶かす。しっかりとオートサンプラバイアルとキャップにサンプルを移す。サンプルは、° C、短期的、-20℃で数日間にて保存することができます。

4。気-液クロマトグラフィー^（GLC）10

1. GLCを開始する前に、ヘリウム、水素と空気ボンベが満たされていることを確認します。
2. 十分なヘキサンを溶媒リザーバーに追加する必要があり、廃棄物の容器を空にする必要があります。脂肪酸アシルメチルエステルの分離のために、マシンにDB - 23カラムを取り付けます。
3. オートサンプラにバイアルを置きます。システムのコンピュータ上でGLC用ケミステーションソフトウェアを起動します。
4. 250℃ヘリウム流量の48.6 mLの分^-1の速度と21.93 psiで圧力とC。で入口温度を設定するスプリット比は30.0である：1。
5. オーブンの温度を2分間140℃で最初に設定し、° C 25 ° C min ^-1の速度で160に送出されます。 ^-その後160から増加させる° C〜250 ° C ° C min ^-1の 8の割合で、250で保持℃〜140減少に続いて4分間C ° C 38の速度で℃以上の温度を設定する^1。一度の実行では、約21分かかります。
6. 水素炎イオン化検出器の温度は270℃です30.0 mLの分^-1、30.0 mLの分^-1で400 mLの分^-1とヘリウムの流量で空気流量の水素流量とC。
7. バイアルおよび実行シーケンステーブルにサンプル名の数を入力してください。バイアルあたり2μLのサンプルを注入して10μL注入器を設定します。
8. 楽器の準備が整うと、実行シーケンスを開始する。

5。代表的な結果：

4週齢のシロイヌナズナの苗からTLCで区切られた脂質の不可逆的な染色の例を図2に示されています。硫酸ステンド脂質（図2A）は黒焦げと褐色の斑点として表示されます。 α-ナフトールは、他の極性脂質が（図2B）、黄色の染色ながら、α-ナフトールはピンク紫色を運ぶで染色等の糖脂質をSQDG、そのようなMGDG、DGDGとして糖脂質を染色することが好ましい。ヨード染色では、可逆的であると脂質のヨウ素が蒸発する（図2C）のような短い時間の経過とともに消え黄色がかった色を与えます。未染色の脂質は脂質の分解を低減することが望ましいですが一時的にヨウ素染色された脂質をGLC分析に供することができる。

が正常に完了した場合、異なる脂肪酸アシルメチルエステルを表す特徴的な信号は、GLC（図3）後に観察されます。短い炭素鎖と少ない二重結合を有する脂肪酸アシルメチルエステルは、DB - 23カラムを使用してより短い保持時間を持っている。脂肪酸アシルメチルエステルのプロファイリングは、変更された脂質組成を有する変異体を識別するための敏感なツールです。図4では、MGDG18：3脂肪酸のモル比が野生型¹⁸に比べてtgd4 - 1変異体で減少している。すべての脂質クラスのモルワン脂質クラスの脂肪酸アシルメチルエステルのモル数を分割することによって、それぞれの脂質のモル比が計算されます。たとえば、MGDGのモル比を計算する：

（MGDG）モル％=Σ[の_{FAME（MGDG）]} /Σ[の_{FAME（合計）]} × 100％

野生型と変異型の両方からの各脂質クラスの結果のモル比を比較することができます。例えば、tgd4 - 1変異体は、MGDGとPGの相対量を増加させたがDGDGとPE（図^5）18の量を減少している。

シロイヌナズナ実生を用いて極性脂質の分析の図1。フローチャート。総脂質は、4週齢のシロイヌナズナの苗から抽出し、TLCによって分離される。分離された脂質をGLC分析に続いてエステル交換のためのTLCプレートから掻きすることができます。

図2。TLCプレート上に脂質の分離。 35 mgの脂質抽出物（新鮮重量）は、野生型の実生は、TLCにより分離し、硫酸（）、α-ナフトール（B）またはヨウ素蒸気（C）で染色されています。三繰り返しは、それぞれの染色法で示されています。 DGDG、digalactosyldiacylglycerol、MGDG、monogalactosyldiacylglycerol、PC、ホスファチジルコリン、PE、ホスファチジルエタノールアミン、PG、phosphatidylglyceROL、PI、ホスファチジルイノシトール、SQDG、スルホキノボシルジアシルグリセロール。

野生型のMGDGから派生した脂肪酸メチルエステル（FAME）の図3。GLC分析。のFAMEが30メートルキャピラリーカラムで分離し、水素炎イオン化によって検出されます。ペンタデカン酸（15:0）は内部標準として使用されます。

図4。野生型Col2に（白のカラム）とtgd4 - 1変異体（黒色カラム）でMGDGの脂肪酸プロフィール。脂肪酸は、二重結合の数が続く炭素の数として表現さ​​れています。三繰り返しは平均され、標準偏差が表示されます。

図5。野生型Col2に（白のカラム）の極性脂質の組成とtgd4 - 1変異体（黒色カラム）。三繰り返しは平均され、標準偏差をエラーバーで示されている。

ディスカッション

GLCと相まってTLCは、植物の極性脂質の定量分析のための堅牢かつ迅速なツールを提供しています。脂質組成のわずかな変化を識別することができるので、この方法は、極性脂質の代謝経路^1,20で損なわ変異の大規模スクリーニングのために使用されています。この方法は、広く基質として極性脂質を利用する酵素の活動を監視するために使用されます^。2,6,7

葉のほかに、そのような根や種子や葉緑体やミトコンドリアなどの細胞内の画のような他の植物組織の脂質組成物はまた、同じ方法で決定することができます。

ここで使用される溶媒系（アセトン、トルエン、水）は、植物の糖脂質とリン脂質の分離に最適化されています。 tetragalactosyldiacylglycerolがPCで実行中しかし、tgd1、2,3,4変異体と分離された葉緑体で、TGDGはPEと一緒に動作します。この場合、クロロホルム、メタノール、酢酸および水（85：20：10：4、V / V / v / v）を溶媒系は^​​13を使用されています。時々 、二つの異なる溶媒系を用いて二次元TLCは、さらに別の糖脂質とリン脂質¹⁹に実行されます。さらに、植物組織は、直接TLC ⁵の初期分離することなく、総脂肪酸のプロファイルを決定するためにGLCが続くFAMEの反応に供することができる。実証TLC - GLCのシステムの横に、脂質プロファイリングに使用する別の方法は、直接エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法¹⁷に基づいています。この方法では抽出物中の脂質の初期のクロマトグラフィー分離は省略されます。しかし、この方法では、ラボや変異体スクリーニングのためのルーチン分析のためのそれはさほど便利で高価な設備と経験豊富な人材を、必要になります。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
α-naphthol	Sigma-Aldrich	N1000
Methanolic HCL 3N	Sigma-Aldrich	33050-U	Dilute to 1N by methanol
Si250-PA TLC plates	JT Baker	7003-04	With pre-absorbent
TLC chamber	Sigma-Aldrich	Z266000
Screw cap tubes	VWR international	53283-800
Scew caps	Sun Sri	13-425
PTFE disk	Sun Sri	200 608
GLC system	Hewlett-Packard	HP6890
DB-23 column	J&W Scientific	122-2332
GLC vials	Sun Sri	500 132
Caps of GLC vials	Sun Sri	201 828
Chemstation software	Agilent Technologies	G2070AA