عضوي النمط ثقافة كاملة ، سمك الشبكية خنزيري الكبار

Summary

نحن هنا وصف تقنية فعالة من حيث التكلفة للثقافة عضوي النمط الشبكية الخنزيري الكبار لمدة سبعة أيام. لفترة وجيزة ، تم استخدام ورقة فلتر العقيمة لرفع الشبكية العصبية الخروج من RPE ومكان الجانب مبصرة حتى على إدراج التي أثارها موقف مخصص الصنع.

Abstract

هناك طلب المعترف بها في النماذج المختبرية التي يمكن أن تحل محل أو تقليل التجارب على الحيوانات. الخنزيري الشبكية لديها بنية مماثلة لشبكية العين البشرية العصبية ، وبالتالي نوعا قيما لدراسة آليات إصابة شبكية العين البشرية والأمراض التنكسية. نحن هنا وصف تقنية فعالة من حيث التكلفة للثقافة عضوي النمط الشبكية الخنازير معزولة عن أعين الكبار الحصول عليها من مسلخ. بعد إزالة الجزء الأمامي ، استخدمت شفرة منقب لإنشاء عدة العصبية الشبكية ، بروك الأغشية المشيمية RPE - - explants الصلبة من الجزء الخلفي من العين الخنزيري الكبار. تم استخدام قطعة من ورق الترشيح العقيمة لرفع الشبكية العصبية الخروج من كل ازدراع. كان المثقف مرشح الورق الشبكية المعقدة (الجانب مبصرة متابعة) an فوق إدراج ، والتي عقدت بعيدا عن قاع الطبق الثقافة من خلال موقف مخصص الصنع. موقف يسمح للتداول جيدة من الثقافة المتوسطة لكلا الجانبين من شبكية العين. عموما ، هذا الإجراء هو بسيط ، واستنساخه ، وتصاريح الحفاظ على بنية شبكية الأصلي لسبعة أيام على الأقل ، مما يجعلها نموذجا مفيدا لمجموعة متنوعة من الدراسات المورفولوجية والدوائية والكيميائية الحيوية على شبكية الثدييات.

Protocol

1. اتخاذ موقف مخصص لصنع إدراج خلية ثقافة

قاعدة معلومات سرية ماصة 5 مل (ISC BioExpress ، # P - 3250 - 19) ويبلغ قطرها الداخلي 13 ملم ، والذي يطابق تماما حجم القاع (12.6 ملم ، وقطرها الخارجي) من 10 ملم (القطر الداخلي) الخلية نونك إدراج الثقافة (8 ميكرومتر ، البولي الغشاء ، الحرارية ، # 137443). لجعل الموقف ، تم قطع ماصة قرب قاعدة لانتاج 6 ملم اسطوانة جوفاء طويلة. ثم أزيلت قطعة من جانب اسطوانة باستخدام شفرة اللهب ساخنة لإنشاء 3 الساقين (4 مم في الارتفاع) ضمن حلقة (2 مم في الارتفاع) ، الأمر الذي أثار ارتفاع إدراج بحوالي 5 ملم.

2. إعداد ورقة لتصفية معقمة مرفق والثقافة الشبكية الخنازير

وقطعت ورقة تصفية Whatman 4M (القط رقم 1004) في شكل دائري (6.3 مليمتر في القطر) مع مقبض صغير الثلاثي الذي كان يستخدم لنقل ورقة الترشيح في أنبوب من الزجاج لتعقيم أو مرة واحدة وكان يعلق على شبكية العين (كما هو الحال يظهر في شريط الفيديو).

3. إعداد explants الشبكية

العيون في الفترة من 5 -- 9 إلى الشهر القديمة ، 150-230 رطلا ، وتم الحصول على الاميركي يوركشاير الخنازير من المسالخ المحلية في غضون ثلاث ساعات من استئصال (تنقل على الثلج). انخفضت لدى وصوله ، وتم تنظيف العينين من الأنسجة الغريبة ، في حل betadine (10 ٪ بوفيدون اليود ، وشركة فريدريك بوردو ، ستامفورد ، ط م) وغسلها مرتين في النسر Dulbecco ومتوسطة التعديل (DMEM مع 1G / L الجلوكوز ، L - الجلوتامين ، والبيروفات الصوديوم ، Cellgro - mediatech شركة ، ومنسى ، VA) تستكمل مع 2.5 ميكروغرام / مل باء الامفوتريسين (Gibco - Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا). تمت إزالة الجزء الأمامي ، وفضح الشبكية العصبية. وقد استخدمت ستة ملم شفرات منقب (ستورز البصريات ، وباوش ومب ، مانشستر ، MO) لخفض الاستوائية ، كامل الجزء الخلفي للسمك explants. وكان في وقت لاحق مقشر الشبكية من خلال تطبيق قبالة بلطف ورقة جافة معقمة على تصفية طبقة الخلايا العقدة ، ورفع قبالة الشبكية العصبية ، ووضع ورقة الترشيح مع شبكية العين تعلق على إدراج الثقافة ومبصرات مواجهة. ثم وضعت على إدراجها في مستنبت ، مع التأكد من تغطية كامل شبكية العين ، في صحن الثقافة 12 - جيدا (فيشر). تم الحصول على explants متعددة بشكل روتيني ومثقف من عين واحدة.

4. نسيج الثقافة

كان المثقف في الأنسجة الشبكية متوسطة النسر الأساسية الدنيا (MEM ، Invitrogen - Gibco لايف تكنولوجيز ، روكفيل ، دكتوراه في الطب) ، ودرجة الحموضة 7.4 ، على أن تستكمل مع 0.2 ملغ / مل الجلوتامين ، 10 الانسولين الخنزيري ميكروغرام / لتر ، 1 البيروفات مم ، 0.1 ملي L - حمض الأسكوربيك ، 100 U / مل البنسلين ، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين ، و 250 نانوغرام / مل الأمفوتريسين B (مضاد حيوي مضاد فطري : سيغما ، وسانت لويس ، MO) ، والغازية مع مرطب 5 ٪ CO ₂ ، والهواء التوازن ، في 37 درجة مئوية. وجرى تبادل المتوسطة كل يومين.

ويمكن استخدام النسيج ، وتعامل مع مجموعة متنوعة من الكواشف أو تحقيقات أو تركت دون علاج لاحقة أو التحليلات البيوكيميائية المورفولوجية. المقطع أدناه يصف الإجراءات لتهيئة كاملة سمك الشبكية متسقة المقاطع العرضية.

5. Sectioning

1. باستخدام ناظم البرد
   1. إصلاح الأنسجة الشبكية في parafomaldehyde 4 ٪ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية ؛
   2. شطف الأنسجة لفترة وجيزة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ؛
   3. إزالة الأنسجة بعناية من ورقة الترشيح ، بينما هو في برنامج تلفزيوني في صحن 35 ملم باستخدام مجهر تشريح ؛
   4. نقل الأنسجة لالسكروز 30 ٪ بين عشية وضحاها والحفاظ على 4 درجات مئوية ؛
   5. شفط بعيدا الحل الزائدة حول الأنسجة ، وإضافة ما يكفي من الأنسجة تيك المتوسطة (مجمع أكتوبر 4583) لتغطية الأنسجة ، والسماح لها نقع في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة لتتغلغل في النسيج ؛
   6. بناء الإطار مربع (10 ملم × 10MM ، 5 ملم الإرتفاع) مع شمع طب الأسنان ، ووضعه في جميع أنحاء الأنسجة ؛ إضافة المزيد من الأنسجة تيك المتوسطة لملء الإطار (تأكد من أن عينات الأنسجة مسطح) ووضع في الثلاجة (-- 20 درجة مئوية) لمدة لا تقل عن 1 ساعة ؛
   7. نقل كتلة عينة مجمدة إلى منصة عينة (تأكد من كتلة العينة العمودي إلى منصة) ؛
   8. تركيب منصة العينة في السابق ناظم البرد المبردة (-20 درجة مئوية ، لايكا ، CM1900) وتأكد من أن كتلة رأسية للشفرة ؛
   9. إزالة الشمع وكتلة الإطار قبل sectioning النسيج في سمك المطلوب ؛
   10. مكان الأقسام على الجيلاتين معاملة الشرائح.
2. باستخدام Vibratome
   1. الإصلاح وشطف النسيج على النحو المبين أعلاه لناظم البرد ؛
   2. مكان النسيج إلى ما قبل ساخنة آغار ذاب ، و 4 ٪ في وعاء صغير والحفاظ على 4 درجات مئوية حتى congeals آغار تماما ؛
   3. استخدام شفرة حادة لخفض آغار الى كتلة صغيرة مع عينات الأنسجة داخل ؛
   4. الغراء كتلة العينة على صاحب العينة vibratome مع الغراء Krazy (تأكد من أن قطعة من عينات الأنسجة رأسيا إلى المنصة من اله صاحب العينة ، أي بشكل عمودي على النصل) وجبل لحامل على نظام vibratome sectioning (لايكا ، السلسلة 1000) مع كتلة العينة مغمورة تماما في المياه الجليدية ؛
   5. خفض كتلة العينة إلى 50 ميكرومتر المقاطع ووضعها على الجيلاتين معاملة الشرائح بفرشاة ناعمة.

6. المناعية

استخدام أي بروتوكول قياسي. يمكن الاطلاع على أجزاء سميكة Immunolabeled مع المجهر مبائر.

7. ممثل النتائج :

كان الحفاظ على التشكل خلال فترة السبعة أيام من الثقافة. صور لشبكية العين قبل وبعد زراعة تتوفر في شريط الفيديو.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وقد أنشأت الباحثين رؤية مجموعة متنوعة من النظم الشبكية الثقافة ، بما في ذلك نظم عضوي النمط ، لدراسة مجموعة متنوعة من القضايا ، مثل زرع الخلايا الجذعية في شبكية العين ¹ ، ² التجدد الشبكية ، والتعبير الجيني الخارجية ^3-5. ومع ذلك ، شبكية الثدييات الكبار م?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد	تعليقات
MEM	Invitrogen - Gibco	10370-021
5 مل ماصة الحافة	ISC BioExpress	ف 3250-19
نونك إدراج خلية ثقافة	حراري	137443	8μm ، البولي
Whatman رقة تصفية 4M	Whatman	1004
DMEM	Cellgro - mediatech المؤتمر الوطني العراقي	10-013 - CV
آغار	Fluka	05040
Fungizone الامفوتريسين B	Invitrogen - Gibco	15290018
شفرات منقب	باوش وومب	T3096	6.00mm
مجمع أكتوبر	الإلكترون المجهر العلوم	62550-01	4583
	علوم
ناظم البرد	لايكا	CM1900
Vibratome	لايكا	سلسلة 1000
مبائر المجهري ؛	كارل زايس	LSM510
المضادة للبروتين متشابك الحويصلة 2 (SV2) الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الماوس	DSHB	N / A
المضادة للبروتين حمضي لييفي الدبقية (GFAP) ضد متعدد النسائل الأرنب	داكو	داكو
Propidium التأيد (PI)	سيغما	P4170