全層の大人のブタの網膜の器官培養

要約

ここでは、七日のための大人のブタの網膜の器官培養のための費用対効果の高い手法を説明します。簡単に言えば、滅菌濾紙は、カスタムメイドのスタンドで発生したインサートにRPEと場所光受容体の側から神経網膜をリフトオフ使用されていました。

要約

動物実験を取り替えるか、または減らすことができるin vitroモデルのための認識が求められています。ブタの網膜は、人間の網膜に似た神経細胞の構造を有し、したがって、人間の網膜損傷や変性疾患のメカニズムを研究するための貴重な種です。ここでは、食肉処理場から得られる目から分離された大人のブタの網膜の器官培養のための費用対効果の高い手法を説明します。前眼部を除去した後、トレパンのブレードは、大人のブタの眼の後部から複数の神経網膜-ブルッフの膜RPE -脈絡-強膜の外植片を作成するために使用されました。滅菌ろ紙片は、それぞれの外植片から神経網膜をリフトオフ使用されていました。ろ紙 - 網膜の複合体は、カスタムメイドのスタンドで培養皿の底部から離れて開催された挿入、上に（最大光受容体の側）培養した。スタンドは、網膜の両側に培地の良い循環が可能になります。全体として、この手順では再現性、シンプルであり、そして少なくとも7日間にネイティブ網膜構造の保存を許可し、それ哺乳類網膜上に、形態学的薬理学的、および生化学的研究の様々な有用なモデルとなっています。

プロトコル

1。細胞培養インサートのためのカスタムメイドのスタンドを作る

5ミリリットルピペットチップ（ISC BioExpress、＃P - 3250 - 19）のベースは完全に10 mmの底部のサイズ（12.6ミリメートル、外径）（内径）NUNCセルに一致する13ミリメートル、内径を持っていますカルチャーインサート（8μmの、ポリカーボネート膜、熱、＃137443）。スタンドを作るために、ピペットを6 mm長中空シリンダーを生産する基地の近くで切断されました。その後、作品は約5 mmでインサートの高さを上げリング（高さ2mm）、で3足（高さ4 mm）を作成するために火炎加熱ブレードを使用してシリンダーの側面から削除されました。

2。ブタ網膜の添付ファイルと文化のための滅菌濾紙の調製

ワットマン4Mフィルターペーパー（カタログ番号1004）（のような殺菌のためにまたは一度に網膜が添付されたガラス管にろ紙を移動するために使用されていた小さな、三角形のハンドルと円形（直径6.3 mm）に切断し、 ）ビデオに示す。

3。網膜外植片の調製

5〜アイズ - 9ヶ月歳まで、150〜230ポンド、アメリカのヨークシャー豚は核出の3時間以内に現地屠殺場（氷の上で輸送）から得た。到着時に、目は、余分な組織を洗浄した（10％ポビドンヨード、パデューフレデリック社、スタンフォード、コネチカット州）betadine溶液に浸漬し、ダルベッコ改変イーグル培地（1グラム/ Lグルコース含有DMEM、L -グルタミン、で2回洗浄しとピルビン酸ナトリウム、Cellgro - mediatech社、マナッセス、VAは）2.5μg/ mlのアムホテリシンB（ギブコ- Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）を補充した。前のセグメントは、神経網膜を露出、削除されました。六ミリトレフィンブレード（ストルツ眼科 - ボシュロム、マンチェスター、MO）は赤道、全層後部セグメントの外植片を切断するために使用された。網膜は、その後、光受容体を上にして、神経網膜上に持ち上げ、そして文化のインサートに接続されている網膜にろ紙を置き、ゆっくりと神経節細胞層の上に、乾燥滅菌ろ紙片を適用することにより、剥離した。インサートは、12穴培養皿（フィッシャー）で、完全に網膜をカバーすることを確認しながら、培養液中に置かれた。複数の外植片は、日常的に得られ、単一の目から培養した。

4。組織の文化

網膜組織は、0.2 mg / mlのグルタミン、10μg/ mlのブタのインシュリン、1m​​Mのピルビン酸、0.1を添加したイーグル最小必須培地（MEM、Invitrogen社、ギブコ-ライフテクノロジーズ社、ロックビル、MD）、pH7.4の、で培養したmMのL -アスコルビン酸、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および250 ng / mlのアンホテリシンB（抗真菌抗生物質：シグマ、セントルイス、MO）、および加湿5％CO _2、バランスの空気を通気、 37℃培地は2日毎に交換した。

組織は、使用する試薬またはプローブのさまざまな治療、またはその後の生化学的または形態学的解析のために未処理のままにすることができます。以下のセクションでは、一貫性のある全層網膜の断面を作成する手順を説明します。

5。セクショニング

1. クライオスタットを使用する
   1. 4℃で一晩4％parafomaldehydeの網膜組織を修復° C;
   2. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で簡単に組織をすすいでください。
   3. それは解剖顕微鏡を使って35mmのディッシュにPBSにあるときに慎重にろ紙から組織を取り除く。
   4. 30％ショ糖に組織を転送し、4℃で一晩おく° C;
   5. 離れて吸引組織の周り余分な溶液を、組織をカバーし、それが組織に浸透するために、室温で2時間浸漬させるのに十分な組織- Tek社の培地（OCTコンパウンド4583）を追加します。
   6. 歯科用ワックスと正方形の枠（10ミリメートル× 10ミリメートル、5mmの高さ）を構築し、組織の周囲に配置します。冷凍庫のフレーム（組織サンプルが平らであることを確認してください）​​と場所を埋めるために、より組織- Tek社の培地を追加する（ - 20 ° C）少なくとも1時間。
   7. サンプルのプラットフォームに凍結サンプルのブロックを転送する（サンプルブロックがプラットフォームに垂直であることを確認してください）​​。
   8. あらかじめ冷却クライオスタット内のサンプルプラットフォームをマウントし（-20℃、ライカ、CM1900）とブロックがブレードに垂直であることを確認してください。
   9. 所望の厚さの組織を切片前にワックスとフレームのブロックを削除します。
   10. ゼラチン処理スライド上のセクションを置きます。
2. ビブラトームの使い方
   1. クライオスタットのために上記のような組織を固定し、すすぎ;
   2. 小さな容器で予備加熱、溶融4％寒天にティッシュを置き、完全に寒天は固まるまで4℃で保つ;
   3. 内部の組織サンプルの小さなブロックに寒天をトリミングする鋭い刃を使用します。
   4. クレイジー接着剤でビブラトームサンプルホルダー（組織サンプルの部分が目のプラットフォームに対して垂直であることを確認する上で接着剤サンプルブロックeのサンプルホルダー、すなわち、垂直翼に）と完全に冷たい水に浸し、サンプルブロックとビブラトーム切片システム（ライカ、シリーズ1000）のホルダーをマウントします。
   5. 50μm以下のセクションにサンプルブロックをカットし、柔らかいブラシでゼラチン処理したスライド上に置きます。

6。免疫組織化学

任意の標準プロトコルを使用してください。免疫標識厚い切片は共焦点顕微鏡で見ることができます。

7。代表的な結果：

形態は文化の7日間の期間中保持された。培養前後の網膜の画像は、ビデオでご利用いただけます。

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ディスカッション

ビジョンの研究者は、網膜幹細胞移植^1、網膜再生^2、および外来遺伝子発現^3月5日などの問題、様々な勉強する器官系、を含む、網膜培養システムのさまざまなを確立している。しかし、成体哺乳類の網膜は、in vitroで光受容体⁶の高エネルギーの需要が主な要因を維持することは困難です。小泉らは、光受容体のための酸素供給が培養インサート?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
MEM	インビトロジェン-ギブコ	10370-021
5 mLのピペットチップ	ISC BioExpress	P - 3250から19
NUNCの細胞培養インサート	熱	137443	8μm、ポリカーボネート
ワットマン4Mフィルターペーパー	ワットマン紙	1004
DMEM	Cellgro - mediatech株式会社	10から013 - CV
寒天	フルカ	05040
FungizoneアムホテリシンB	インビトロジェン-ギブコ	15290018
トレフィンブレード	ボシュロム	T3096	6.00ミリメートル
OCTコンパウンド	電子顕微鏡学	62550〜01	4583
	科学
クライオスタット	ライカ	CM1900
ビブラトーム	ライカ	シリーズ1000
共焦点顕微鏡。	カールツァイス	LSM510
反シナプス小胞タンパク質2（SV2）マウスモノクローナル抗体	DSHB	N /
抗グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）ポリクローナルウサギ抗体	DAKO	DAKO
ヨウ化プロピジウム（PI）	シグマ	P4170