Cultura organotípicas de Full-espessura Retina Porcina Adulto

Resumo

Aqui nós descrevemos uma técnica de custo-benefício para a cultura de retina organotípicas suína adulto por sete dias. Resumidamente, um papel estéril filtro foi utilizado para levantar a retina neural fora do RPE e do lado coloque fotorreceptoras em cima uma inserção levantadas por um carrinho feito por encomenda.

Resumo

Há uma demanda reconhecida por modelos in vitro que podem substituir ou reduzir a experimentação animal. Retina suína tem uma estrutura semelhante neuronal a retina humana e, portanto, uma espécie valiosa para estudar mecanismos de lesão da retina humana e doenças degenerativas. Aqui nós descrevemos uma técnica de custo-benefício para a cultura de retina organotípicas suína adulto isolado de olhos obtido a partir de um matadouro. Após a remoção do segmento anterior, uma lâmina de trépano foi usado para criar múltiplas retina neural-Bruch membrana-RPE-coróide esclera-explantes do segmento posterior de olhos de porco adulto. Um pedaço de papel filtro estéril foi utilizada para levantar a retina neural off de cada explante. O complexo de papel-filtro retina foi cultivado (lado fotorreceptor para cima) em cima de uma inserção, que foi realizada longe do fundo do prato de cultura por um carrinho feito por encomenda. O stand permite uma boa circulação do meio de cultura para ambos os lados da retina. Globalmente, este procedimento é simples, reprodutível e permite a preservação da estrutura da retina nativo para pelo menos sete dias, tornando-se um modelo útil para uma variedade de estudos morfológicos, farmacológicos e bioquímicos na retina de mamíferos.

Protocolo

1. Fazendo uma posição custom-made para inserções de cultura de células

A base de uma pipeta 5 ml ponta (ISC BioExpress, # P-3250-19) tem um diâmetro interno de 13 mm, o que combina perfeitamente com o tamanho inferior (12,6 mm, diâmetro externo) de um de 10 mm (diâmetro interno) de células NUNC inserir a cultura (8 mM, Policarbonato membrana, térmica, # 137443). Para fazer o suporte, a pipeta foi cortada perto da base para produzir de 6 mm longo cilindro oco. Então, as peças foram removidas do lado do cilindro usando uma lâmina chama-aquecido para criar três pernas (4 mm de altura) com um anel (2 mm de altura), que elevou a altura das inserções em cerca de 5 mm.

2. Preparação de papel de filtro estéril para penhora e cultura de retina suína

Whatman 4M papel de filtro (Cat. 1004) foi cortado em uma forma circular (6,3 mm de diâmetro) com uma alça, pequena triangular que foi usado para mover o papel de filtro para um tubo de vidro para esterilização ou uma vez que a retina foi unido (como mostrado no vídeo).

3. Preparação de explantes da retina

Olhos de 5 - a 9 meses de idade, 150-230 lbs, porcos americanos Yorkshire foram obtidas de um abatedouro local dentro de três horas de enucleação (transportadas em gelo). Após a chegada, os olhos foram limpos de tecido estranhos, mergulhados em solução de betadine (10% de povidona-iodo, A Purdue Empresa Frederique, Stamford, CT) e lavadas duas vezes em Modified Dulbecco Eagle Medium (DMEM com 1 g / L de glicose, L-glutamina, e piruvato de sódio, Cellgro-Mediatech Inc., Manassés, VA) suplementado com 2,5 mg / ml anfotericina B (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA). O segmento anterior foi removido, expondo a retina neural. Lâminas de seis milímetros trefina (Storz Ophthalmic-Bausch and Lomb, Manchester, MO) foram usados ​​para cortar equatorial, de espessura total explantes segmento posterior. A retina foi posteriormente tirou delicadamente a aplicação de um pedaço de papel de filtro seco estéril para a camada de células ganglionares, desprendendo-se da retina neural, e colocando o papel de filtro com retina inscritos para a inserção da cultura, fotorreceptores voltada para cima. A pastilha foi então colocado em meio de cultura, certificando-se cobrir totalmente a retina, em uma placa de cultura de 12 poços (Fisher). Explantes múltiplos foram obtidos rotineiramente e cultivadas a partir de um único olho.

4. Cultura de tecidos

O tecido da retina foi cultivada em meio mínimo essencial de Eagle (MEM, Gibco-Invitrogen-Life Technologies Inc., Rockville, MD), pH 7,4, suplementado com 0,2 mg / ml de glutamina, 10 de insulina suína mcg / ml, 1 mM de piruvato, 0,1 mM de ácido L-ascórbico, 100 U / ml de penicilina, estreptomicina 100 mg / ml e 250 ng / ml anfotericina B (antibiótico antimicótico: Sigma, St. Louis, MO), e aerada com umidificado 5% de CO _2, ar, equilíbrio a 37 ° C. Meio foi trocado a cada dois dias.

Tecidos podem ser usados, tratados com uma variedade de reagentes ou sondas, ou deixados sem tratamento para posterior análises bioquímicas ou morfológicas. A seção abaixo descreve os procedimentos para criar consistente espessura total da retina seções transversais.

5. Seccionamento

1. Usando um Criostato
   1. Fix tecido da retina em parafomaldehyde 4% durante a noite a 4 ° C;
   2. Enxaguar tecido brevemente com tampão fosfato salino (PBS);
   3. Remova cuidadosamente o tecido do papel de filtro enquanto ele está em PBS em um prato de 35 mm, utilizando um microscópio de dissecação;
   4. Transferência de tecido para sacarose 30% e manter durante a noite a 4 ° C;
   5. Sucção afastado o excesso de solução em todo o tecido, adicione suficiente Tissue-Tek médio (OCT Compound 4583) para cobrir o tecido, e deixe de molho em temperatura ambiente por 2 horas a permear o tecido;
   6. Construir uma moldura quadrada (10 mm x 10mm, 5 mm de altura) com cera dental e coloque-o em volta do tecido; adicionar mais meio Tissue-Tek para preencher o quadro (certifique-se a amostra de tecido é plana) e colocar em um freezer (- 20 ° C) durante pelo menos 1 hora;
   7. Transferência do bloco de amostra congelada a uma plataforma de amostra (certifique-se o bloco de amostra é vertical para a plataforma);
   8. Montar a plataforma de exemplo em um criostato pré-resfriado (-20 ° C, Leica, CM1900) e certifique-se o bloco é vertical para a lâmina;
   9. Remover a cera eo bloco de quadros antes do corte do tecido na espessura desejada;
   10. Coloque as seções sobre gelatina tratados com slides.
2. Usando um Vibratome
   1. Fix e lavar o tecido, como descrito acima para o Criostato;
   2. Coloque o tecido em pré-aquecido, agar derretido 4% em um pequeno recipiente e manter a 4 ° C até o agar congela completamente;
   3. Use uma lâmina afiada para cortar o agar em um pequeno bloco com a amostra de tecido para dentro;
   4. Bloco cola a amostra em um porta-amostras vibratome com cola Krazy (certifique-se o pedaço de amostra de tecido é vertical para a plataforma de the porta-amostras, ou seja, perpendicular à lâmina) e montar o titular em um sistema vibratome seccionamento (Leica, Série 1000) com o bloco de amostra completamente submerso em água gelada;
   5. Corte o bloco de amostra em 50 seções mm e colocá-los em gelatina tratados com slides com uma escova macia.

6. Imuno-histoquímica

Usar qualquer protocolo padrão. Immunolabeled de espessura podem ser vistos com um microscópio confocal.

7. Resultados representativos:

Morfologia foi preservada durante o período de sete dias de cultura. Imagens da retina antes e após o cultivo estão disponíveis no vídeo.

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Discussão

Pesquisadores visão criaram uma variedade de sistemas de cultura da retina, incluindo sistemas de organotípicas, para estudar uma variedade de questões, tais como o transplante de células-tronco da retina ^1, a regeneração da retina ^2, e expressão de genes exógenos ^3-5. No entanto, a retina de mamíferos adultos é difícil manter in vitro, principalmente devido à alta demanda de energia dos ⁶ fotorreceptores. Koizumi et al. Descrito um sistema de cul...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
MEM	Invitrogen-Gibco	10370-021
5 mL ponta da pipeta	ISC BioExpress	P-3250-19
NUNC inserir cultura de células	Térmico	137443	8μm, Policarbonato
Whatman 4M papel de filtro	Whatman	1004
DMEM	Cellgro-Mediatech Inc	10-013-CV
Agar	Fluka	05040
Fungizone Anfotericina B	Invitrogen-Gibco	15290018
Lâminas trépano	Bausch and Lomb	T3096	6,00 milímetros
Composto outubro	Microscopia Eletrônica de Ciências	62550-01	4583
	Ciências
Criostato	Leica	CM1900
Vibratome	Leica	Série 1000
Microscopia confocal;	Carl Zeiss	LSM510
Anti-Synaptic Protein vesículas 2 (SV2) anticorpo monoclonal	DSHB	N / A
Anti-Glial proteína ácida fibrilar (GFAP) anticorpo policlonal de coelho	DAKO	DAKO
Iodeto de propídio (PI)	Sigma	P4170