תרבות Organotypic של הרשתית מלא עובי למבוגרים חזירי

Summary

כאן אנו מתארים שיטה חסכונית לתרבות organotypic של הרשתית חזירי הבוגרת במשך שבעה ימים. בקצרה, נייר סינון סטרילי שימש להרים את הרשתית העצבית מן הרשתית ואת photoreceptor מקום על הצד להוסיף שהעלו לעמוד מחוייט.

Abstract

יש ביקוש מוכר במודלים חוץ גופית זה יכול להחליף או לצמצם את הניסויים בבעלי חיים. הרשתית חזירי יש מבנה עצבי דומה הרשתית האנושית ולכן הוא זן בעל ערך לחקר המנגנונים של פגיעה ברשתית האנושית מחלה ניוונית. כאן אנו מתארים שיטה חסכונית לתרבות organotypic של הרשתית חזירי מבוגר מבודד מעיני המתקבל מטבחיים. לאחר הסרת פלח קדמי, להב המקדחה נעשה שימוש כדי ליצור מספר רב של עצבי הרשתית, ברוך קרום הרשתית, דמית העין, בלובן העין של explants מן קטע האחורי של העיניים חזירי מבוגר. פיסת נייר סינון סטרילי שימש להרים את הרשתית העצבית מן explant כל אחד. המתחם מסנן נייר הרשתית היה מתורבת (צד photoreceptor ומעלה) על גבי להוסיף, שהתקיים הרחק בתחתית הצלחת לעמוד על ידי תרבות מחוייט. לעמוד מאפשרת זרימת טוב של המדיום תרבות על שני הצדדים של הרשתית. ככלל, הליך זה הוא פשוט, לשחזור, ומאפשרת שימור של מבנה הרשתית יליד לפחות שבעה ימים, מה שהופך אותו מודל שימושי עבור מגוון רחב של מחקרים מורפולוגיים, תרופתי, ו ביוכימי על הרשתית יונקים.

Protocol

1. ביצוע לעמוד בהזמנה אישית עבור מוסיף תרבית תאים

הבסיס של 5 מ"ל פיפטה קצה (ISC BioExpress, # P-3250-19) הוא בעל קוטר פנימי של 13 מ"מ, אשר בהחלט מתאים לגודל התחתון (12.6 מ"מ, קוטרו החיצוני) של 10 מ"מ (קוטר פנימי) תא NUNC הכנס תרבות (8 מיקרומטר, פוליקרבונט הממברנה, תרמי, # 137443). כדי להפוך את העמדה, פיפטה נותק סמוך לבסיס כדי לייצר גליל 6 מ"מ חלול ארוך. ואז, הוסרו חלקים מהצד של גליל באמצעות להב להבה מחוממים כדי ליצור 3 רגליים (4 מ"מ גובה) תחת טבעת (2 מ"מ גובה), אשר העלה את גובה הכנסות על ידי כ 5 מ"מ.

2. הכנת נייר סינון סטרילי עבור התקשרות והתרבות של הרשתית חזירי

Whatman 4M נייר סינון (חתול מס '1004) נחתך לצורה עגולה (6.3 מ"מ קוטר) עם ידית, משולש קטן ששימש להעברת הנייר לסנן לתוך שפופרת זכוכית עבור עיקור או פעם הרשתית צורף (כמו המוצג בסרטון).

3. הכנת explants רשתית

עיניים מ - 5 חודשים-9 הישן, 150-230 ק"ג, אמריקן חזירים יורקשייר התקבלו שחיטה מקומית בתוך שלוש שעות של enucleation (מועבר על הקרח). עם ההגעה, העיניים נוקו של רקמת זרים, טבול פתרון בבטאדין (10% Povidone-יוד, החברה פרדריק פרדו, סטמפורד, CT) ורחץ פעמיים השתנה Dulbecco הנשר בינוני (DMEM עם גלוקוז 1g / L, L-גלוטמין, ו pyruvate נתרן, Cellgro-mediatech Inc, Manasses, VA) בתוספת 2.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​amphotericin B (Gibco-Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה). פלח קדמי הוסר, חשיפת הרשתית העצבית. ששת מ"מ להבים המקדחה (Storz עיניים, באוש לומב, מנצ'סטר, MO) שימשו לחתוך המשוונית, עובי מלא explants קטע האחורי. הרשתית היה קלופים לאחר מכן את ידי בעדינות החלת פיסת נייר יבש מסנן סטרילי על שכבת תא הגנגליון, מרימים את הרשתית העצבית, ומעמידים את הנייר עם מסנן הרשתית מחוברים על להכניס את התרבות, photoreceptors פונה כלפי מעלה. הכנס הושם מכן לתוך בינוני תרבות, והקפד לכסות באופן מלא את הרשתית, בצלחת 12 גם תרבות (פישר). Explants מרובים הושגו שגרתי תרבותי מן העין אחת.

4. רקמות תרבות

רקמת הרשתית היה בתרבית בינוני Essential Minimum הנשר (ממ, Invitrogen-Gibco-Life טכנולוגיות בע"מ, Rockville, MD), pH 7.4, בתוספת 0.2 מ"ג / מ"ל ​​גלוטמין, 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​אינסולין חזירי, pyruvate 1 מ"מ, 0.1 L-חומצה אסקורבית מ"מ, 100 U / ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו 250 ng / ml amphotericin B (אנטיביוטי Antimycotic: Sigma, סנט לואיס, מיזורי), ואת סודה עם 5% CO ₂ humidified, האוויר איזון, בשעה 37 ° C. בינוני הוחלפה כל יומיים.

רקמות יכול לשמש, מטופלים עם מגוון רחב של חומרים כימיים או בדיקות, או מטופל עבור ניתוחים ביוכימיים או מורפולוגיים הבאים. הקטע שלהלן מתאר את הנהלים כדי ליצור עקביות עובי הרשתית מלא חתכים.

5. חתך

1. שימוש cryostat
   1. תיקון רקמת הרשתית ב parafomaldehyde 4% בין לילה ב 4 מעלות צלזיוס;
   2. יש לשטוף את רקמת בקצרה עם פוספט שנאגרו מלוחים (PBS);
   3. בזהירות להסיר את הרקמה מנייר מסנן בזמן שהוא ב-PBS בצלחת 35 מ"מ באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה;
   4. העברת רקמות סוכרוז 30% ולשמור לילה ב 4 מעלות צלזיוס;
   5. יניקה משם את הפתרון עודף סביב הרקמה, להוסיף מספיק רקמות-Tek בינוני (מתחם אוקטובר 4583) כדי לכסות את הרקמה, ולתת לו להשרות בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות לחדור רקמות;
   6. בניית מסגרת רבועה (10 מ"מ x 10 מ"מ, גובה 5 מ"מ) עם שעווה שיניים למקם אותו סביב הרקמה; להוסיף יותר רקמות-Tek בינוני כדי למלא את המסגרת (לוודא את דגימת רקמות שטוחה) ומניחים במקפיא (- 20 ° C) לפחות שעה 1;
   7. מעבירים את גוש מדגם קפוא פלטפורמה מדגם (לוודא לחסום מדגם אנכי לבמה);
   8. הר פלטפורמה מדגם cryostat מראש מקורר (-20 ° C, לייקה, CM1900) ולוודא לחסום הוא אנכי להב;
   9. הסרת שעווה לחסום מסגרת לפני חתך את הרקמה על עובי הרצוי;
   10. מניחים את הסעיפים על ג'לטין שטופלו שקופיות.
2. שימוש Vibratome
   1. תקן ולשטוף את הרקמה כפי שתואר לעיל עבור cryostat;
   2. הנח את רקמת לתוך אגר, מחומם מראש 4% מומס במיכל קטן ולשמור על 4 מעלות צלזיוס עד נקרש אגר לחלוטין;
   3. השתמש בלהב חד לחתוך את אגר לגוש קטן עם מדגם רקמות בפנים;
   4. ההדבקה מדגם בלוק על בעל מדגם vibratome בדבק מגע עם דבק (לוודא את פיסת רקמה מדגם אנכי לפלטפורמה של הדואר בעל המדגם, כלומר, בניצב להב) ואת הר בעל חתך על מערכת vibratome (לייקה, סדרה 1000) עם לחסום את המדגם שקוע לחלוטין במי קרח;
   5. חותכים את גוש מדגם לתוך 50 מיקרומטר חלקים ומניחים אותם על ג'לטין שטופלו שקופיות עם מברשת רכה.

6. אימונוהיסטוכימיה

השתמש בכל הפרוטוקול הסטנדרטי. חלקים עבים Immunolabeled ניתן לצפות באמצעות מיקרוסקופ confocal.

7. נציג תוצאות:

מורפולוגיה השתמרה במשך שבעת הימים של התרבות. תמונות של הרשתית לפני ואחרי culturing זמינים הווידאו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

החוקרים Vision הקימו מגוון רחב של מערכות תרבות ברשתית, כולל מערכות organotypic, ללמוד מגוון רחב של נושאים, כגון תא גזע השתלת רשתית ^1, התחדשות הרשתית ^2, ביטוי גנים אקסוגניים ^3-5. עם זאת, הרשתית יונקים בוגרים קשה לשמור במבחנה, בעיקר בשל אנרגיה גבוהה לדרישות phot...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
מ	Invitrogen-Gibco	10370-021
5 מ"ל פיפטה קצה	ISC BioExpress	P-3250-19
תרבות NUNC תא להכניס	תרמי	137443	8μm, פוליקרבונט
Whatman נייר סינון 4M	Whatman	1004
DMEM	Cellgro-mediatech Inc	10-013-CV
אגר	Fluka	05040
Fungizone amphotericin B	Invitrogen-Gibco	15290018
המקדחה להבי	באוש לומב	T3096	6.00mm
אוקטובר מתחם	מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים	62550-01	4583
	למדעים
Cryostat	לייקה	CM1900
Vibratome	לייקה	סדרה 1000
Confocal מיקרוסקופית;	Carl Zeiss	LSM510
Anti-Synaptic שלפוחיות חלבון 2 (SV2) נוגדנים חד שבטיים העכבר	DSHB	N / A
נגד גליה Fibrillary חומציים חלבון (GFAP) נוגדן ארנבת polyclonal	DAKO	DAKO
Propidium יודיד (PI)	סיגמא	P4170