Organotypischen Kultur der Full-Dicke ausgewachsenen Schweinen Retina

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine kostengünstige Methode zur organotypischen Kultur von ausgewachsenen Schweinen Netzhaut für sieben Tage. Kurz gesagt, wurde ein steriles Filterpapier verwendet, um die neuronalen Netzhaut abheben von der RPE und Ort Photorezeptor Seite nach oben auf einem Einsatz von einem maßgeschneiderten Stand angehoben.

Zusammenfassung

Es ist ein anerkannter Bedarf an In-vitro-Modellen, zu ersetzen oder reduzieren kann Tierversuch. Porcine Netzhaut hat eine ähnliche neuronale Struktur der menschlichen Netzhaut und ist daher eine wertvolle Arten für das Studium Mechanismen der menschlichen Netzhaut Verletzungen und degenerativen Erkrankungen. Hier beschreiben wir eine kostengünstige Methode zur organotypischen Kultur von ausgewachsenen Schweinen Netzhaut vor Augen von einem Schlachthof erhalten isoliert. Nach dem Entfernen der vorderen Segment wurde ein Trepan Klinge verwendet, um mehrere neurale Retina-Bruch-Membran-RPE-Aderhaut-Sklera Explantate aus dem hinteren Bereich des ausgewachsenen Schweinen Augen zu schaffen. Ein Stück sterile Filterpapier wurde verwendet, um die neuronalen Netzhaut abhebt von jedem Explantat. Das Filterpapier-Retina-Komplex wurde kultiviert (Photorezeptor Seite nach oben) auf dem Gipfel eines Einsatzes, die vom Boden der Kulturschale mit einem maßgeschneiderten Stand gehalten wurde. Der Stand ermöglicht eine gute Zirkulation des Kulturmediums auf beiden Seiten der Netzhaut. Insgesamt ist dieses Verfahren einfach, reproduzierbar und erlaubt Erhaltung der einheimischen retinalen Struktur für mindestens sieben Tage, so dass es ein nützliches Modell für eine Vielzahl von morphologischen, pharmakologische und biochemische Untersuchungen an Säugetieren Netzhaut.

Protokoll

1. Einen maßgeschneiderten stehen für Zellkultur-Einsätzen

Die Basis eines 5 ml Pipettenspitze (ISC BioExpress, # P-3250 bis 19) hat einen Innendurchmesser von 13 mm, das entspricht genau dem Boden Größe (12,6 mm, Außendurchmesser) einer 10 mm (Innendurchmesser) NUNC Zelle Kultur einzufügen (8 um, Polycarbonat-Membran, Thermal, # 137443). Um den Stand, wurde die Pipette nahe der Basis geschnitten, um einen 6 mm langen Hohlzylinder erzeugt. Dann wurden Stücke aus der Seite des Zylinders entfernt mit einer Flamme erwärmt Klinge bis 3 Beine (4 mm in der Höhe) unter einem Ring (2 mm Höhe), die die Höhe der Einsätze um etwa 5 mm angehoben erstellen.

2. Herstellung von sterilen Filterpapier für den Anbau und die Kultur der Schweine Netzhaut

Whatman 4M Filterpapier (Kat. Nr. 1004) wurde in eine runde Form (6,3 mm im Durchmesser) mit einem kleinen, dreieckigen Griff, der für die Bewegung der Filterpapier in einem Glasrohr zur Sterilisation oder wenn die Netzhaut angebracht wurde verwendet wurde geschnitten (wie gezeigt, in dem Video).

3. Vorbereitung der Netzhaut Explantate

Eyes aus 5 - bis 9-Monate alten, 150-230 lbs, waren amerikanische Yorkshire Schweine aus einem örtlichen Schlachthof innerhalb von drei Stunden Enukleation (Transport auf Eis) gewonnen. Nach der Ankunft, die Augen von fremden Gewebe gereinigt wurden, tauchte in betadine Lösung (10% Povidon-Iod, der Purdue Frederique Company, Stamford, CT) und zweimal in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM mit 1g / l Glucose, L-Glutamin, und Natriumpyruvat, CellGro-mediatech Inc., Manasse, VA) mit 2,5 g / ml Amphotericin B (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA) ergänzt. Das vordere Segment wurde entfernt, so dass die neuronalen Netzhaut. Six-mm Trepan Klingen (Storz Ophthalmic-Bausch und Lomb, Manchester, MO) wurden verwendet, um äquatorialen, voller Dicke hinteren Segment Explantate abgeschnitten. Die Netzhaut wurde anschließend durch leichtes Anlegen ein Stück trockenes steriles Filterpapier auf die Ganglienzellschicht, Abheben der neuralen Netzhaut, und indem das Filterpapier mit angeschlossenem Netzhaut auf die Kultur legen, Photorezeptoren nach oben abgezogen. Der Einsatz wurde dann in Kulturmedium gebracht, so dass Sie sicher, dass zur Deckung der Netzhaut, in einer 12-well Kulturschale (Fisher). Mehrere Explantate wurden routinemäßig und erhielt kultivierte aus einem einzigen Auge.

4. Gewebekultur

Die Retina wurde in Minimum Essential Eagle-Medium (MEM, Invitrogen-Gibco-Life Technologies Inc., Rockville, MD), pH 7,4, ergänzt mit 0,2 mg / ml Glutamin, 10 pg / ml Insulin vom Schwein, 1 mM Pyruvat, 0,1 mM L-Ascorbinsäure, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 250 ng / ml Amphotericin B (Antibiotika antimykotische: Sigma, St. Louis, MO), und kohlensäurehaltiges mit befeuchteten 5% CO _2, Balance Luft, bei 37 ° C. Das Medium wurde alle 2 Tage gewechselt.

Tissue kann verwendet werden, behandelt mit einer Vielzahl von Reagenzien oder Sonden oder links für nachfolgende biochemische oder morphologische Analysen unbehandelt. Der folgende Abschnitt beschreibt Verfahren, um konsistente voller Dicke der Netzhaut Querschnitte erstellen.

5. Sectioning

1. Mit einem Kryostat
   1. Fix Netzhautgewebe in 4% parafomaldehyde über Nacht bei 4 ° C;
   2. Das Gewebe spülen kurz mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS);
   3. Entfernen Sie vorsichtig das Gewebe aus dem Filterpapier, während es in PBS in einer 35 mm Schale mit einem Dissektionsmikroskop;
   4. Transfer-Gewebe zu 30% Saccharose und halten über Nacht bei 4 ° C;
   5. Saug entfernt die überschüssige Lösung um das Gewebe zu erhalten, ausreichend Tissue-Tek Medium (OCT Compound 4583), um Gewebe decken, und lassen Sie es bei Raumtemperatur für 2 Stunden einweichen, um das Gewebe durchdringen;
   6. Baue einen quadratischen Rahmen (10 mm x 10 mm, 5 mm Höhe) mit Dentalwachs und legen Sie sie in das Gewebe, fügen Sie mehr Tissue-Tek Medium mit dem Rahmen (sicherstellen, dass die Gewebeprobe ist flach) und in einen Gefrierschrank zu füllen (- 20 ° C) für mindestens 1 Stunde;
   7. Übertragen Sie die gefrorene Probe blockieren, um eine Probe-Plattform (sicherstellen, dass die Sample-Block steht senkrecht auf der Plattform);
   8. Montieren Sie die Probe-Plattform in einem vorgekühlten Kryostaten (-20 ° C, Leica, CM1900) und stellen Sie sicher, dass der Block steht senkrecht auf der Klinge;
   9. Entfernen Sie das Wachs und den Rahmen zu blockieren, bevor Schneiden des Gewebes in der gewünschten Dicke;
   10. Setzen Sie die Teile auf Gelatine-behandelten Objektträgern.
2. Mit einem Vibratom
   1. Fix und spülen Sie das Gewebe wie oben für den Kryostat beschrieben;
   2. Legen Sie das Gewebe in vorgewärmte, geschmolzen 4% Agar in einen kleinen Behälter und halten bei 4 ° C, bis der Agar erstarrt vollständig;
   3. Mit einem scharfen Messer auf die Agar in einen kleinen Block mit der Gewebeprobe Innenverkleidung;
   4. Kleben Sie die Sample-Block auf einer Vibratom Probenhalter mit Krazy Kleber (stellen Sie sicher, das Stück Gewebeprobe steht senkrecht auf der Plattform von the Probenhalter, dh senkrecht zur Klinge) und montieren Sie die Halterung auf einem Vibratom Schneidesystem (Leica, Series 1000) mit der Probe Block vollständig im eisigen Wasser getaucht;
   5. Schneiden Sie die Sample-Block in 50 Abschnitte um und legen Sie sie auf Gelatine-behandelten Folien mit einer weichen Bürste.

6. Immunhistochemie

Verwenden Sie Standard-Protokoll. Immunolabeled dicke Schnitte können mit einem konfokalen Mikroskop betrachtet werden.

7. Repräsentative Ergebnisse:

Morphologie wurde während des Zeitraums von sieben Tagen der Kultur erhalten. Bilder der Netzhaut vor und nach der Kultivierung sind in dem Video.

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Diskussion

Vision-Forscher haben eine Vielzahl von Netzhaut-Kultur etabliert, darunter organotypischen Systeme, um eine Vielzahl von Themen, wie Retina Stammzelltransplantation ^1, retinale Regeneration ² und exogene Genexpression ^3-5 studieren. Allerdings ist erwachsener Säugetiere Netzhaut schwer aufrecht zu erhalten in vitro, vor allem aufgrund der hohen Energiebedarf der Photorezeptoren ^6. Koizumi et al. Beschrieben ein Kaninchen Netzhaut organotypischen Kultur, in ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
MEM	Invitrogen-Gibco	10370-021
5 ml Pipettenspitze	ISC BioExpress	P-3250 bis 19
NUNC Zellkultureinsatzes	Thermisch	137443	8μm, Polycarbonat
Whatman 4M Filterpapier	Whatman	1004
DMEM	CellGro-mediatech Inc	10 bis 013-CV
Agar	Fluka	05040
Fungizone Amphotericin B	Invitrogen-Gibco	15290018
Trephine Klingen	Bausch and Lomb	T3096	6.00mm
OCT-Verbindung	Electron Microscopy Sciences	62550-01	4583
	Sciences
Kryostat	Leica	CM1900
Vibratom	Leica	Serie 1000
Die konfokale Mikroskopie;	Carl Zeiss	LSM510
Anti-synaptischen Vesikel Protein 2 (SV2) monoklonalen Maus-Antikörper	DSHB	N / A
Anti-sauren Gliafaserproteins (GFAP) polyklonale Kaninchen-Antikörper	DAKO	DAKO
Propidiumiodid (PI)	Sigma	P4170