Органотипической Культура Полная толщина сетчатки взрослых свиней

Резюме

Здесь мы опишем экономически эффективный способ органотипической культуру взрослой сетчатке свиней в течение семи дней. Короче говоря, стерильной фильтровальной бумаги была использована для лифта нейронных сетчатку от от ПЭС и место фоторецепторов вверх на вставке поднятых на заказ стенда.

Аннотация

Существует спрос на признанных в пробирке моделей, которые могут заменить или уменьшить экспериментах на животных. Свиной сетчатки имеет аналогичную структуру нейронов в сетчатке глаза человека и, следовательно, ценных пород для изучения механизмов сетчатки человека травм и дегенеративных заболеваний. Здесь мы опишем экономически эффективный способ органотипической культуру взрослой сетчатке свиньи изолированы от глаза получена из скотобойни. После удаления переднего сегмента, лезвие трепан была использована для создания нескольких нейронных сетчатки Бруха мембранно-РПЭ-сосудистое-склеры эксплантов из заднего сегмента глаза взрослой свиньи. Кусок стерильной фильтровальной бумаги была использована для лифта нейронных сетчатку от каждого эксплантов. Фильтровальная бумага-сетчатки комплекс культивировали (фоторецепторов стороной вверх) на вершине вставку, которая проходила вдали от нижней части культуры блюдо на заказ стенда. Стенд позволяет для хорошей циркуляции питательной среды по обе стороны от сетчатки. В целом, эта процедура проста, воспроизводимые, и позволяет сохранение родного сетчатки структуры, по крайней мере за семь дней, что делает ее полезной модели для различных морфологических, фармакологических и биохимических исследований на млекопитающих сетчатки.

протокол

1. Создание заказных стенд для вставки культуре клеток

База 5 мл пипетки (ISC BioExpress, № Р-3250-19) имеет внутренний диаметр 13 мм, что идеально соответствует нижней размера (12,6 мм, внешний диаметр) 10 мм (внутренний диаметр) Nunc ячейки культуры вставки (8 мкм, поликарбонат мембраны, тепловые, # 137443). Для того, чтобы стоять, пипетка была отрезана у основания, чтобы произвести 6 мм полый цилиндр. Затем части были удалены из стороны цилиндра использованием пламени подогревом лезвия, чтобы создать 3 ноги (4 мм в высоту) под кольцо (2 мм в высоту), которые вызывают высота вставки примерно на 5 мм.

2. Подготовка стерильной фильтровальной бумаги для крепления и культуры свиного сетчатки

Ватман 4М Фильтровальная бумага (Cat № 1004) был разрезан на круглой формы (6,3 мм в диаметре) с небольшой, треугольной ручкой, который использовался для перемещения фильтровальной бумаги в стеклянную трубку для стерилизации или один раз в сетчатку была прикреплена (как показано на видео).

3. Подготовка сетчатки эксплантов

Глаза от 5 - до 9-месячного, 150-230 кг, американский Йоркшир свиней были получены из местной скотобойни в течение трех часов энуклеации (перевозимых на льду). Прибыв на место, глаза были очищены от посторонних ткани, смоченной в бетадин решение (10% повидон-йод, компании Purdue Фредерик, Stamford, CT) и дважды промывают изменения Eagle Дульбеко Средняя (DMEM с 1 г / л глюкозы, L-глутамин, и пируват натрия, Cellgro-Mediatech Inc, Манассия, В. А.) с добавлением 2,5 мкг / мл амфотерицина B (Gibco-Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). Переднего сегмента был удален, выставляя нейронных сетчатки. Шесть-мм трепан лопастей (Storz Офтальмология-Бауш и Ломб, Манчестер, штат Миссури) были использованы, чтобы сократить экваториальный, на всю толщину задних эксплантов сегменте. Сетчатка была впоследствии снимают, осторожно применения кусок сухой стерильной фильтровальной бумаги на слой ганглиозных клеток, отрывая нейронных сетчатки, и размещение фильтровальную бумагу с прикрепленными на сетчатке культуры вставки, фоторецепторы вверх. Вставки помещается в культуральной среде, убедившись, что для полного покрытия сетчатки, в 12-и культуре блюдо (Фишер). Несколько эксплантов были получены в плановом порядке и культурных из одного глаза.

4. Культуры ткани

Ткани сетчатки культивировали в минимально необходимого среднего Орла (MEM, Invitrogen-Gibco-Life Technologies Inc, Роквилл, штат Мэриленд), рН 7,4 с добавлением 0,2 мг / мл глутамина, 10 мкг / мл свиного инсулина, 1 мМ пирувата, 0,1 мМ L-аскорбиновой кислоты, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 250 нг / мл амфотерицина B (противогрибковым антибиотикам: Sigma, Сент-Луис, Миссури), и газированные с увлажненной 5% CO _2, баланс воздуха, при 37 ° C. Средний был обменен каждые два дня.

Ткань может быть использован, получавших различные реагенты или датчиков, или не лечить для последующих биохимических или морфологического анализа. Ниже раздел описывает процедуры создания последовательной полную толщину сетчатки сечений.

5. Секционирование

1. Использование Криостат
   1. Fix ткани сетчатки в 4% parafomaldehyde течение ночи при 4 ° С;
   2. Промойте ткань кратко фосфатным буферным раствором (PBS);
   3. Осторожно снимите ткань фильтровальную бумагу пока он находится в PBS в 35 мм с помощью блюдо рассечение микроскопа;
   4. Передача ткани до 30% сахарозы и держать в течение ночи при 4 ° С;
   5. Всасывающая излишки раствора вокруг ткани, добавьте достаточное ткани-Tek среды (октябрь 4583 соединений), чтобы покрыть ткань, и пусть он помочь при комнатной температуре в течение 2 часов, чтобы проникать в ткани;
   6. Сборка площади кадра (10 мм х 10 мм, 5 мм) с зубным воском и место его вокруг ткани; добавить больше ткани-Tek среду, чтобы заполнить кадр (убедитесь, что образец ткани плоская) и поместить в морозильную камеру (- 20 ° С) в течение не менее 1 часа;
   7. Передача замороженных блоков образец образец платформы (убедитесь, что образец блока вертикального на платформе);
   8. Горы образец платформы в предварительно охлажденный криостате (-20 ° C, Leica, CM1900) и убедитесь, что блок вертикального на лезвие;
   9. Удаление воском и рама блока перед срезов ткани на нужной толщины;
   10. Место разделы по желатин обработанные слайды.
2. Использование Vibratome
   1. Fix и полоскания тканей, как описано выше криостат;
   2. Место ткани в предварительно нагретую, растопленное 4% агара в небольшой контейнер и хранить при температуре 4 ° С до агар застывает полностью;
   3. Используйте острое лезвие для обрезки агар в небольшой блок с образца ткани внутри;
   4. Клей образец блока на vibratome держатель образца с Krazy клея (убедитесь, что кусочек ткани образец вертикального на платформе йэлектронной держателя образца, т. е. перпендикулярно к лезвию) и установите держатель на vibratome секционирования системы (Leica, серия 1000) с образцом блок полностью погружен в ледяную воду;
   5. Вырезать образец блока в 50 мкм разделов и разместить их на желатин обработанные слайды с мягкой щеткой.

6. Иммуногистохимия

Используйте любой стандартный протокол. Immunolabeled толстых секций могут быть просмотрены с помощью конфокальной микроскопии.

7. Представитель Результаты:

Морфология была сохранена в течение семи дней культуры. Изображения сетчатки до и после культивирования доступны в видео.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Видение исследователи установили различные сетчатки системы культуры, в том числе органотипической систем, для изучения различных вопросов, таких как сетчатки трансплантации стволовых клеток ^{1, 2} регенерации сетчатки и экзогенных экспрессии генов ^3-5. Тем не менее, взрослый...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
MEM	Invitrogen-Gibco	10370-021
5 мл пипетки	ISC BioExpress	P-3250-19
Nunc культуре клеток вставки	Тепловой	137443	8 мкм, поликарбонат
Ватман 4М Фильтровальная бумага	Ватман	1004
DMEM	Cellgro-Mediatech Inc	10-013-CV
Агар	Fluka	05040
Fungizone Амфотерицин	Invitrogen-Gibco	15290018
Трепан лезвия	Bausch & Lomb и	T3096	6.00mm
Октябрь соединения	Электронная микроскопия наук	62550-01	4583
	Наук
Криостат	Leica	CM1900
Vibratome	Leica	Серии 1000
Конфокальной микроскопии;	Carl Zeiss	LSM510
Анти-Synaptic пузырьков белка 2 (SV2) мышиное моноклональное антитело	DSHB	N / A
Анти-глиальных фибриллярного кислого белка (GFAP) поликлональных антител кролика	DAKO	DAKO
Пропидия йодидом (PI)	Сигма	P4170