Cultura organotípicos de espesor completo Retina adulto porcino

Resumen

Aquí se describe una técnica coste-efectiva para la cultura de la retina organotípicos adulto porcino durante siete días. En pocas palabras, un papel de filtro estéril se utilizó para levantar la retina neural fuera de la EPR y los fotorreceptores hasta el lugar parte de una inserción que plantea un soporte a medida.

Resumen

Existe una demanda reconocida por los modelos in vitro que pueden sustituir o reducir los experimentos con animales. Retina porcina tiene una estructura similar neuronal de la retina humana y por lo tanto, es una especie valiosa para el estudio de los mecanismos de lesión de retina humana y las enfermedades degenerativas. Aquí se describe una técnica coste-efectiva para la cultura de la retina organotípicos adulto porcino aislado de ojos obtuvo de un matadero. Después de retirar el segmento anterior, una hoja de trépano se utiliza para crear múltiples neural retina, la membrana de Bruch-RPE-coroides-esclera explantes del segmento posterior de ojos porcinos adultos. Un pedazo de papel de filtro estéril se utilizó para levantar la retina neural lejos de cada explante. El filtro de papel-retina complejos, se cultivó (lado de los fotorreceptores hasta) encima de una inserción, que se celebró fuera de la parte inferior de la placa de cultivo por un soporte a medida. El soporte permite una buena circulación del medio de cultivo a ambos lados de la retina. En general, este procedimiento es simple, reproducible, y permite la preservación de la estructura de la retina nativos por lo menos durante siete días, por lo que es un modelo útil para una variedad de estudios morfológicos, farmacológicos y bioquímicos en la retina de mamíferos.

Protocolo

1. Hacer un soporte hecho a medida para las inserciones de cultivo celular

La base de un 5 ml punta de la pipeta (ISC BioExpress, # P-3250-19) tiene un diámetro interior de 13 mm, que se adapta perfectamente al tamaño inferior (12,6 mm, diámetro exterior) de 10 mm (diámetro interior) de células NUNC insertar la cultura (8 micras, de policarbonato de membrana, térmica, # 137443). Para hacer la base, la pipeta se cortó cerca de la base para producir un cilindro hueco de 6 mm de largo. Luego, las piezas fueron retirados de la parte del cilindro con una hoja de la llama calienta para crear tres patas (4 mm de altura) en un anillo (2 mm de altura), que elevó la altura de los insertos de aproximadamente 5 mm.

2. Preparación de papel de filtro estéril para la unión y la cultura de la retina porcina

4M papel de filtro Whatman (Cat. No. 1004) fue cortado en forma circular (6,3 mm de diámetro) con una pequeña asa, de forma triangular que se utiliza para mover el papel de filtro en un tubo de vidrio para la esterilización o una vez que la retina se adjunta (como muestra en el video).

3. Preparación de explantes de retina

Ojos de 5 - a 9 meses de edad, 150-230 libras, American cerdos Yorkshire se obtuvieron de un matadero local en las tres horas de la enucleación (transportados en hielo). A su llegada, los ojos se limpiaron de tejido extraño, sumergido en una solución de betadine (10% de povidona yodada, la compañía Purdue Frederique, Stamford, CT) y se lavó dos veces en Dulbecco modificado del medio Eagle (DMEM con 1 g / L de glucosa, L-glutamina, y piruvato de sodio, Cellgro-mediateca Inc., Manasés, VA) suplementado con 2,5 mg / ml de anfotericina B (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA). El segmento anterior fue removido, dejando al descubierto la retina neural. Seis hojas mm trépano (Storz Oftálmica-Bausch and Lomb, Manchester, MO) se utiliza para cortar ecuatorial, de espesor total de explantes del segmento posterior. La retina se despegó posteriormente fuera aplicando suavemente un trozo de papel de filtro seco estéril sobre la capa de células ganglionares, el levantamiento de la retina neural, y colocar el papel de filtro con retina aplicada en el encaje cultural, los fotorreceptores hacia arriba. El inserto se colocaron en medio de cultivo, asegurándose de cubrir la totalidad de la retina, en una placa de cultivo de 12 pocillos (Fisher). Explantes múltiples se obtuvieron de manera rutinaria y cultivadas a partir de un solo ojo.

4. De cultivo de tejidos

El tejido de la retina se cultivó en medio esencial mínimo de Eagle (MEM, Gibco-Invitrogen, Life Technologies Inc., Rockville, MD), pH 7,4, suplementado con 0,2 mg / ml de glutamina, 10 mg / ml de insulina porcina, 1 mM piruvato, 0,1 mM ácido L-ascórbico, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 250 ng / ml de anfotericina B (antibióticos antimicóticos: Sigma, St. Louis, MO), y la gaseada, con humidificado 5% de CO _2, el aire el equilibrio, a 37 ° C. Medio fue cambiado cada dos días.

Los tejidos se pueden utilizar, tratados con una variedad de reactivos o sondas, o se deja sin tratamiento para su posterior análisis bioquímico o morfológico. La siguiente sección describe los procedimientos para crear consistente de todo el espesor de retina secciones.

5. Seccionamiento

1. El uso de un criostato
   1. Fix tejido de la retina en el 4% parafomaldehyde la noche a 4 ° C;
   2. Enjuague el tejido brevemente con tampón fosfato salino (PBS);
   3. Retire con cuidado el tejido del papel de filtro mientras está en PBS en una placa de 35 mm utilizando un microscopio de disección;
   4. La transferencia de tejido al 30% de sacarosa y mantener la noche a 4 ° C;
   5. Aspiración lejos el exceso de solución de todo el tejido, agregar suficiente Tissue-Tek medio (compuesto octubre 4583) para cubrir el tejido, y deje reposar a temperatura ambiente durante 2 horas a penetrar en el tejido;
   6. Construir un marco cuadrado (10 mm x 10 mm, 5 mm de altura) con cera dental y el lugar que todo el tejido; añadir más Tissue-Tek medio para llenar el encuadre (asegúrese de que la muestra de tejido plano) y el lugar en un congelador (- 20 ° C) durante al menos 1 hora;
   7. Transferencia del bloque de muestra congelada a una plataforma de muestra (asegúrese de que el bloque de la muestra está en posición vertical a la plataforma);
   8. Montaje de la plataforma de la muestra en un criostato pre-enfriado (-20 ° C, Leica, CM1900) y asegúrese de que el bloque es perpendicular a la hoja;
   9. Quite la cera y el bloque de marco antes de seccionar el tejido en el espesor deseado;
   10. Coloque las secciones de gelatina tratados con diapositivas.
2. El uso de un Vibratome
   1. Fijar y aclarar el tejido como se describe arriba para el criostato;
   2. Coloque el tejido en el pre-calentado, agar fundido al 4% en un recipiente pequeño y mantenga a 4 ° C hasta que el agar se solidifica por completo;
   3. Utilizar una cuchilla para cortar el agar en un bloque pequeño con la muestra de tejido en el interior;
   4. Cola de la muestra en un bloque de soporte de muestra vibratome con pegamento Krazy (asegúrese de que la pieza de muestra de tejido es vertical a la plataforma de the titular de la muestra, es decir, perpendicular a la hoja) y montar el soporte en un sistema vibratome de seccionamiento (Leica, serie 1000) con el bloque de la muestra completamente sumergido en agua helada;
   5. Cortar el bloque de la muestra en secciones de 50 micras y colocarlos en gelatina tratados con diapositivas con un cepillo suave.

6. Inmunohistoquímica

Usar cualquier protocolo estándar. Immunolabeled de espesor pueden ser vistos con un microscopio confocal.

7. Los resultados representativos:

Morfología se conservan durante el período de siete días de la cultura. Imágenes de la retina antes y después del cultivo están disponibles en el video.

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Discusión

Investigadores de la visión han establecido una variedad de sistemas de cultivo de la retina, incluyendo los sistemas de organotípicos, para estudiar una variedad de temas, tales como el trasplante de células madre de la retina ^1, la regeneración de la retina ^2, y la expresión de genes exógenos ^3-5. Sin embargo, la retina de mamíferos adultos es difícil de mantener in vitro, principalmente debido a las altas demandas de energía de los ⁶ fotorreceptores. Koizu...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
MEM	Invitrogen-Gibco	10370-021
5 ml punta de la pipeta	ISC BioExpress	P-3250-19
Celular NUNC insertar la cultura	Térmico	137443	8μm, policarbonato
Filtro de papel Whatman 4M	Whatman	1004
DMEM	Cellgro-mediateca Inc	10 a 013 CV
Agar	Fluka	05040
Fungizone anfotericina B	Invitrogen-Gibco	15290018
Trépano hojas	Bausch & Lomb	T3096	6.00mm
Compuesto octubre	Microscopía electrónica de Ciencias	62550-01	4583
	Ciencias
Criostato	Leica	CM1900
Vibratome	Leica	Serie 1000
La microscopía confocal;	Carl Zeiss	LSM510
Anti-Vesícula sináptica proteína 2 (SV2) anticuerpo monoclonal de ratón	DSHB	N / A
Anti-glial fibrilar ácida de la proteína (GFAP) anticuerpo policlonal de conejo	Dako	Dako
Yoduro de propidio (PI)	Sigma	P4170