Culture organotypique de pleine épaisseur Retina porcin adultes

Résumé

Nous décrivons ici une technique rentable pour la culture organotypique de la rétine porcine adulte pour sept jours. En bref, un papier filtre stérile a été utilisé pour soulever la rétine neurale décollé de l'EPR et le côté photorécepteur lieu sur un insert soulevées par un stand sur mesure.

Résumé

Il ya une demande reconnue pour des modèles in vitro qui peuvent remplacer ou de réduire l'expérimentation animale. Rétine porcin a une structure similaire à la rétine humaine neuronale et est donc une espèce précieuse pour l'étude des mécanismes de blessure rétinienne humaine et les maladies dégénératives. Nous décrivons ici une technique rentable pour la culture organotypique de la rétine porcine adulte isolé yeux obtenue à partir d'un abattoir. Après avoir retiré le segment antérieur, une lame de trépan a été utilisé pour créer de multiples neurones rétine Bruch membrane RPE-choroïde-sclérotique explants du segment postérieur des yeux de porc adulte. Un morceau de papier filtre stérile a été utilisé pour soulever la rétine neurale hors de chaque explant. Le filtre en papier-rétine complexes a été cultivé (côté photorécepteur vers le haut) au sommet d'un insert, qui a eu lieu loin de la bas de la boîte de culture par un stand sur mesure. Le stand permet une bonne circulation du milieu de culture des deux côtés de la rétine. Globalement, cette procédure est simple, reproductible, et permet la préservation de la structure de la rétine natif pour au moins sept jours, ce qui en fait un modèle utile pour une variété d'études morphologiques, pharmacologiques et biochimiques sur la rétine des mammifères.

Protocole

1. Faire un stand sur mesure pour inserts de culture cellulaire

La base d'une pointe de la pipette 5 ml (ISC BioExpress, # P-3250-19) a un diamètre intérieur de 13 mm, ce qui correspond parfaitement à la taille inférieure (12,6 mm, diamètre extérieur) d'un 10 mm (diamètre interne) de cellules NUNC insert de culture (8 pm, membrane en polycarbonate, thermique, # 137443). Pour rendre le stand, la pipette a été coupé près de la base pour produire un long cylindre de 6 mm creux. Ensuite, les morceaux ont été retirés du côté du cylindre à l'aide d'une lame chauffée à la flamme afin de créer trois pattes (4 mm de hauteur) dans le cadre d'un anneau (2 mm de hauteur), qui a soulevé la hauteur des inserts d'environ 5 mm.

2. Préparation du papier filtre stérile pour la fixation et à la culture de la rétine porcine

Whatman 4M papier filtre (Cat n ​​° 1004) a été coupé dans une forme circulaire (6,3 mm de diamètre) avec une petite poignée triangulaire qui a été utilisé pour déplacer le papier filtre dans un tube de verre pour la stérilisation ou une fois la rétine a été fixé (comme montré dans la vidéo).

3. Préparation des explants rétiniens

Yeux de 5 - à 9 mois vieux, 150-230 lbs, American porcs Yorkshire ont été obtenus à partir d'un abattoir local dans les trois heures de l'énucléation (transporté sur glace). À leur arrivée, les yeux ont été nettoyées des tissus étrangers, plongé dans une solution de bétadine (10% de povidone-iode, La Société de Purdue Frédérique, Stamford, CT) et lavé à deux reprises en milieu Dulbecco modifié Eagle (DMEM avec 1g / L de glucose, L-glutamine, et le pyruvate de sodium, Cellgro-mediatech Inc, Manassé, VA) complémenté avec 2,5 pg / ml d'amphotéricine B (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA). Le segment antérieur a été retirée, exposant la rétine neurale. Six mm lames trépan (Storz-ophtalmique Bausch and Lomb, Manchester, MO) ont été utilisés pour couper l'équateur, de pleine épaisseur explants segment postérieur. La rétine est décollée par la suite délicatement appliquant un morceau de papier filtre stérile sec sur la couche de cellules ganglionnaires, soulevant la rétine neurale, et de placer le papier filtre avec la rétine attachée sur l'insert de la culture, les photorécepteurs vers le haut. L'insert a été ensuite placé dans un milieu de culture, en veillant à couvrir entièrement la rétine, dans une boîte de culture à 12 puits (Fisher). Explants multiples ont été obtenues régulièrement et cultivé à partir d'un seul œil.

4. La culture de tissus

Le tissu rétinien a été cultivé à Eagle milieu minimum essentiel (MEM, Invitrogen Gibco-Life-Technologies Inc, Rockville, MD), pH 7,4, additionné de 0,2 mg / ml de glutamine, 10 insuline porcine pg / ml, 1 mM de pyruvate, de 0,1 mM acide L-ascorbique, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine et 250 ng / ml d'amphotéricine B (antibiotiques Antimycosique: Sigma, St. Louis, MO), et aérés avec humidifié à 5% de CO _2, l'air l'équilibre, à 37 ° C. Le milieu est changé tous les deux jours.

Les tissus peuvent être utilisés, traités avec une variété de réactifs ou de sondes, ou elle n'est pas traitée pour la suite des analyses biochimiques ou morphologiques. La section ci-dessous décrit les procédures pour créer des cohérente de pleine épaisseur rétinienne sections.

5. Sectionnement

1. L'utilisation d'un cryostat
   1. Fixer le tissu rétinien au parafomaldehyde 4% la nuit à 4 ° C;
   2. Rincer brièvement avec les tissus tampon phosphate salin (PBS);
   3. Retirer délicatement le tissu du papier filtre pendant qu'il est en PBS dans un plat de 35 mm en utilisant un microscope à dissection;
   4. Transfert des tissus à 30% de sucrose et de garder une nuit à 4 ° C;
   5. Aspiration loin l'excès de solution à travers le tissu, ajouter suffisamment Tissue-Tek moyennes (composé OCT 4583) pour couvrir les tissus, et laissez-le tremper à température ambiante pendant 2 heures à imprégner le tissu;
   6. Construire un cadre carré (10 mm x 10mm, 5 mm de hauteur) avec de la cire dentaire et le placer autour du tissu; ajouter plus Tissue-Tek moyenne pour remplir le cadre (assurez-vous que l'échantillon de tissu est plat) et placer dans un congélateur (- 20 ° C) pendant au moins 1 heure;
   7. Transférer le bloc de l'échantillon congelé à une plate-forme de l'échantillon (assurez-vous que le bloc de l'échantillon est perpendiculaire à la plate-forme);
   8. Monter la plate-forme de l'échantillon dans un cryostat pré-refroidi (-20 ° C, Leica, CM1900) et assurez-vous que le bloc est perpendiculaire à la lame;
   9. Enlever la cire et le bloc de châssis avant de sectionner le tissu à l'épaisseur désirée;
   10. Placez les sections sur la gélatine traitée diapositives.
2. L'utilisation d'un Vibratome
   1. Fix et rincer le tissu comme décrit ci-dessus pour le cryostat;
   2. Placer le tissu en pré-chauffée, 4% d'agar fondu dans un petit récipient et maintenir à 4 ° C jusqu'à ce que l'agar se fige complètement;
   3. Utilisez une lame tranchante pour couper l'agar-agar dans un petit bloc avec l'échantillon de tissu à l'intérieur;
   4. Collez le bloc de l'échantillon sur un porte-échantillon vibratome avec Krazy Glue (assurez-vous que le morceau de l'échantillon de tissu est perpendiculaire à la plate-forme de ee porte-échantillon, c'est à dire, perpendiculaire à la lame) et monter le support sur un système vibratome sectionnement (Leica, série 1000) avec le bloc de l'échantillon complètement immergé dans l'eau glacée;
   5. Couper le bloc de l'échantillon dans 50 sections um et les placer sur la gélatine traitée lames avec une brosse douce.

6. L'immunohistochimie

Utiliser tout protocole standard. Immunomarquées sections épaisses peuvent être visualisées avec un microscope confocal.

7. Les résultats représentatifs:

Morphologie a été préservée durant la période de sept jours de culture. Les images de la rétine, avant et après mise en culture sont disponibles dans la vidéo.

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Discussion

Vision chercheurs ont établi une variété de systèmes de culture de la rétine, y compris les systèmes organotypiques, pour étudier une variété de questions, telles que des cellules souches rétiniennes transplantation ^1, de la régénération rétinienne ^2, et l'expression des gènes exogènes ^3-5. Toutefois, les adultes rétine des mammifères est difficile à maintenir in vitro, principalement due à la forte demande en énergie des ⁶ photorécepteurs. K...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires
MEM	Invitrogen Gibco-	10370-021
5 ml pipette	ISC BioExpress	P-3250-19
Insérez NUNC culture cellulaire	Thermique	137443	8μm, Polycarbonate
Filtre papier Whatman 4M	Whatman	1004
DMEM	Cellgro-mediatech Inc	10 à 013-CV
Agar	Fluka	05040
Fungizone amphotéricine B	Invitrogen Gibco-	15290018
Lames Trephine	Bausch & Lomb	T3096	6,00 mm
Composé OCT	Sciences Electron Microscopy	62550-01	4583
	Sciences
Cryostat	Leica	CM1900
Vibratome	Leica	Série 1000
La microscopie confocale;	Carl Zeiss	LSM510
Protéines des vésicules synaptiques Anti-2 (SV2) anticorps monoclonal de souris	DSHB	N / A
Anti-protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) anticorps polyclonal de lapin	DAKO	DAKO
Iodure de propidium (PI)	Sigma	P4170