Tam kalınlıkta Yetişkin Domuz Retina Organotipik Kültür

Özet

Burada yedi gün yetişkin porcine retinanın Organotipik kültürü için bir maliyet-etkin bir yöntem açıklanmaktadır. Kısaca, steril bir filtre kağıdı nöral retina ısmarlama stand tarafından gündeme getirilen bir ekleme RPE ve yer fotoreseptör yüzü yukarı kaldırmak için kullanılır oldu.

Özet

Hayvan deneylerinde değiştirmek veya azaltabilir in vitro modeller için tanınan bir talep vardır. Domuz retina nöronal insan retina benzer bir yapısı vardır ve bu nedenle insan retina hasarı ve dejeneratif hastalık mekanizmaları çalışmak için değerli bir türdür. Burada bir mezbahaya elde gözleri izole yetişkin porcine retinanın Organotipik kültürü için bir maliyet-etkin bir tekniktir. Ön segment çıkardıktan sonra, trefin bıçak yetişkin porcine gözlerin arka segment birden fazla nöral retina Bruch membran RPE-koroid-sklerasına eksplantlar oluşturmak için kullanılmıştır. Nöral retina her eksplant kaldırmak için bir parça steril filtre kağıdı kullanıldı. Filtre kağıdı-retina kompleks, ısmarlama stand kültür çanak alt uzak yapıldı bir ekleme tepesine (en fotoreseptör yan) kültüre edildi. Stand retinanın her iki taraf için kültür ortamı iyi sirkülasyonu sağlar. Genel olarak, bu işlem tekrarlanabilir, basit ve en az yedi gün için doğal retina yapısının korunmasına izin verir, bir memeli retina üzerine çeşitli morfolojik, farmakolojik ve biyokimyasal çalışmalar için faydalı model.

Protokol

1. Hücre kültürü ekler için özel yapılmış bir stand yapma

5 ml pipet (ISC BioExpress, P-3250-19) tabanı, 13 mm, 10 mm alt boyutu (12.6 mm, dış çapı) (iç çapı) Nunc hücre mükemmel eşleşen bir iç çapı kültür eki (8 mikron, Polikarbonat membran, Termal, # 137.443). Pipet standı yapmak için, 6 mm uzunluğunda içi boş silindir üretmek için baz istasyonunun yakınında kesildi. Sonra parçaları, yaklaşık 5 mm yükseklik ekler kaldırdı bir halka (yüksekliği 2 mm) altında 3 bacaklarda (4 mm yükseklik) oluşturmak için bir alev ısıtılmış bıçak kullanarak silindirin yan çıkarıldı.

2. Domuz retinanın eki ve kültürü için steril filtre kağıdı hazırlanması

Whatman 4M Filtre kağıdı (Cat No: 1004) (as sterilizasyonu için ya da bir kez retinaya bağlı olduğu bir cam tüp içine filtre kağıdı taşımak için kullanılan küçük bir üçgen kulplu (çapı 6.3 mm) dairesel bir şekil kesildi video gösterilir).

3. Retina eksplantlar hazırlanması

Gözler 5 - 9 aylık 150-230 kg, eski, Amerikan Yorkshire domuz enükleasyon üç saat içinde yerel bir mezbahaya (buz üzerinde taşınan) elde edilmiştir. Varışta, gözleri dışarıdaki doku temizlenir vardı,, betadin çözüm (10% Povidon-İyot, Purdue Frederique Şirket, Stamford, CT) batırılmış ve Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (1g / L glukoz DMEM, L-glutamin iki kere yıkanır ve sodyum piruvat, Cellgro-Mediatech A.Ş., Manasses, VA) 2.5 mg / ml Amfoterisin B (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA) ile desteklenmiştir. Ön segment nöral retina açığa çıkarıldı. Altı mm trefin bıçakları (Storz Oftalmik Bausch and Lomb, Manchester, MO), ekvator, tam kalınlıkta arka segment eksplantlar kesmek için kullanılır. Retinanın daha sonra yavaşça ganglion hücre tabakası üzerine bir parça kuru steril filtre kağıdı uygulayarak nöral retina kaldırma ve kültür eklemek üzerine bağlı retina ile filtre kağıdı yerleştirerek, fotoreseptör yukarı bakacak şekilde sıyrılır. Eklemek sonra 12-iyi bir kültür çanak (Fisher), retina tamamen kapsayacak şekilde emin olmak için, kültür ortamı içine yerleştirildi. Birden çok eksplantlarında rutin olarak elde edilen ve tek bir göz kültüre edildi.

4. Doku kültürü

Retina dokusunun (MEM, Invitrogen-Gibco-Life Technologies Inc, Rockville, MD), pH 7.4, 0.2 mg / ml glutamin, 10 mg / ml porcine insülin, 1 mM piruvat, 0.1 ile desteklenen Eagle Minimum Essential Orta kültür mM L-askorbik asit, 100 U / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin ve 250 ng / ml amfoterisin B (antimikotik Antibiyotik: Sigma, St Louis, MO) ve nemlendirilmiş% 5 CO _2, denge hava gazlı 37 ° C Orta iki günde bir değiştirildi.

Doku, kullanılan reaktifler veya probları çeşitli tedavi veya sonraki biyokimyasal ve morfolojik analizler için tedavi edilmezse olabilir. Aşağıdaki bölümde, tutarlı tam kalınlıkta retina kesitler oluşturmak için prosedürler açıklanmaktadır.

5. Kesit

1. Kriyostat Kullanımı
   1. 4 gece 4% parafomaldehyde Fix retina dokusunun ° C;
   2. Fosfat tamponlu salin (PBS) ile kısaca doku durulayın;
   3. Bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak 35 mm çanak PBS ise filtre kağıdı dikkatlice doku kaldırmak;
   4. % 30 sukroz doku transferi ve 4 gece boyunca devam ° C;
   5. Uzakta Emiş doku çevresinde aşırı bir çözüm, doku karşılamak için yeterli Doku-Tek orta (OCT Bileşik 4583) ekleyin ve dokuya nüfuz için 2 saat boyunca oda sıcaklığında bekletme izin;
   6. Diş balmumu ile kare kare (10 mm x 10 mm, 5 mm yükseklik) oluşturun ve doku çevresinde yer, bir derin dondurucuda bir kare (doku örneği düz olduğundan emin olun) ve yerini doldurmak için daha fazla Doku-Tek orta eklemek (- 20 ° C) en az 1 saat;
   7. Örnek bir platform (örnek blok platform dik olduğundan emin olun) dondurulmuş örnek blok Transferi;
   8. Daha önceden soğutulmuş bir Kriyostat Mount örnek platformu (-20 ° C, Leica, CM1900) ve blok bıçak dik olduğundan emin olun;
   9. Istenilen kalınlıkta doku kesit önce mum ve çerçeve bloğu çıkarın;
   10. Jelatin tedavi slaytlar bölümlerde yerleştirin.
2. Vibratome Kullanımı
   1. Düzeltme ve doku Kriyostat için yukarıda açıklandığı gibi durulama;
   2. Doku küçük bir kapta önceden ısıtılmış% 4, erimiş agar içine yerleştirin ve 4 ° C agar congeals kadar tamamen tutmak;
   3. Küçük bir blok içindeki doku örneği agar kesmek için keskin bir bıçak kullanın;
   4. Tutkal örnek blok vibratome Krazy yapıştırıcı ile bir numune tutucu (parça doku örneği th platform dik olduğundan emin olune numune tutucu, yani, dik bıçak) ve buzlu su tamamen sular altında örnek blok ile vibratome bir kesit sistemi (Leica Serisi 1000) tutucu monte;
   5. 50 mikron bölüme örnek blok kesin ve yumuşak bir fırça ile jelatin-tedavi slaytlar üzerine koyun.

6. İmmünohistokimya

Herhangi bir standart protokol kullanın. Immunolabeled kalınlığında kesitler konfokal mikroskop ile görülebilir.

7. Temsilcisi Sonuçlar:

Morfoloji kültür yedi günlük süre boyunca korundu. Kültür öncesi ve sonrası retinanın Görüntüler video mevcuttur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Vizyon araştırmacılar, retina kök hücre ^nakli 1, retina ^rejenerasyon 2, ve dışsal gen ^ekspresyonu 3-5 gibi çeşitli sorunları, çalışma Organotipik sistemleri de dahil olmak üzere, çeşitli retina kültür sistemleri kurduk . Ancak, yetişkin memeli retina, in vitro fotoreseptörlerin ⁶ yüksek enerji talepleri nedeniyle muhafaza edilmesi güçtür. Koizumi ve ark. Fotoreseptörlerin için oksijen kaynağı, kültür eklemek yüksekliği yükselt...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
MEM	Invitrogen-Gibco	10370-021
5 ml pipet	ISC BioExpress	P-3250-19
Nunc hücre kültürü eklemek	Termal	137443	8μm, Polikarbonat
Whatman 4M Filtre kağıdı	Whatman	1004
DMEM	Cellgro-Mediatech Inc.	10-013-CV
Agar	Fluka	05040
Fungizone Amfoterisin B	Invitrogen-Gibco	15290018
Trefin bıçaklar	Bausch & Lomb	T3096	6.00mm
Ekim Bileşik	Elektron Mikroskopi Bilimler	62550-01	4583
	Bilimler
Kriyostat	Leica	CM1900
Vibratome	Leica	1000 Serisi
Mikroskopisi;	Carl Zeiss	LSM510
Anti-Synaptic veziküllü Protein 2 (SV2) fare monoklonal antikor	DSHB	N / A
Anti-glial fibriler asidik protein (GFAP) poliklonal tavşan antikoru	DAKO	DAKO
Propidium İyodür (PI)	Sigma	P4170