Cultura organotipica di tutto spessore Retina suina adulti

Riepilogo

Qui si descrive una soluzione economica per la cultura tecnica organotipica di retina suini adulti per sette giorni. In breve, una carta sterile filtro è stato usato per sollevare la retina neurale fuori dal RPE e fotorecettori lato posto su un inserto sollevata da una misura stand.

Abstract

Vi è una domanda riconosciuto per modelli in vitro che può sostituire o ridurre gli esperimenti sugli animali. Retina suina ha una struttura simile a neuronale retina umana ed è quindi una specie preziosa per lo studio dei meccanismi di lesione della retina umana e le malattie degenerative. Qui si descrive una soluzione economica per la cultura tecnica organotipica di retina suini adulti isolati da occhi ottenuti da un mattatoio. Dopo aver rimosso il segmento anteriore, una lama trapano è stato utilizzato per creare più neurali retina-membrana di Bruch-RPE-coroide, sclera espianti dal segmento posteriore degli occhi suini adulti. Un pezzo di carta da filtro sterile è stato utilizzato per sollevare la retina neurale fuori da ogni espianto. Il filtro di carta retina complesso è stato colto (lato fotorecettori verso l'alto) in cima a un inserto, che si è tenuto lontano dal fondo del piatto la cultura da una misura stand. Il supporto permette una buona circolazione del terreno di coltura su entrambi i lati della retina. Nel complesso, questa procedura è semplice, riproducibile, e permette la conservazione dei nativi struttura della retina per almeno sette giorni, che lo rende un modello utile per una varietà di studi morfologici, farmacologico, biochimico e sulla retina dei mammiferi.

Protocollo

1. Fare una misura stand per inserti in colture cellulari

La base di una pipetta da 5 ml di punta (ISC BioExpress, # P-3250-19) ha un diametro interno di 13 mm, che corrisponde perfettamente alla dimensione inferiore (12,6 mm, diametro esterno) di mm 10 (diametro interno) di cellule NUNC inserto cultura (8 micron, membrana in policarbonato, termica, # 137443). Per rendere lo stand, la pipetta è stata tagliata vicino alla base per la produzione da 6 mm lungo cilindro cavo. Poi, i pezzi sono stati rimossi dal lato del cilindro usando una fiamma riscaldato lama di creare 3 gambe (4 mm di altezza) con un anello (2 mm di altezza), che ha sollevato l'altezza degli inserti di circa 5 mm.

2. Preparazione di carta da filtro sterile per il fissaggio e la cultura della retina suina

Carta da filtro Whatman 4M (Cat. No. 1004) è stato tagliato in una forma circolare (6,3 mm di diametro) con una piccola impugnatura triangolare che è stato utilizzato per spostare la carta da filtro in un tubo di vetro per la sterilizzazione o una volta che la retina è stata allegata (come mostrato nel video).

3. Preparazione di espianti di retina

Occhi da 5 - a 9 mesi di età, 150-230 lbs, americani maiali Yorkshire sono stati ottenuti da un mattatoio locale entro tre ore di enucleazione (trasportati in ghiaccio). All'arrivo, gli occhi sono stati puliti del tessuto estraneo, immerso in soluzione betadine (10% Povidone-iodio, la Società Purdue Frederique, Stamford, CT) e lavato due volte in Dulbecco modificato (DMEM con 1 g / L di glucosio, L-glutamina, e piruvato di sodio, Cellgro-Mediatech Inc., Manasse, VA) integrato con 2,5 mg / ml di amfotericina B (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA). Il segmento anteriore è stato rimosso, esponendo la retina neurale. Sei mm lame trapano (Storz oftalmica-Bausch & Lomb, Manchester, MO) sono stati utilizzati per tagliare equatoriale, a tutto spessore espianti segmento posteriore. La retina è stata successivamente staccate delicatamente applicando un pezzo di carta asciutta da filtro sterile sullo strato di cellule gangliari, alzando il piede della retina neurale, e mettendo la carta da filtro con retina attaccato sul inserto cultura, fotorecettori verso l'alto. L'inserto è stato poi inserito in terreno di coltura, avendo cura di coprire completamente la retina, in un piatto ben 12-cultura (Fisher). Espianti multiple sono state ottenute regolarmente e colto da un solo occhio.

4. Tessuto cultura

Il tessuto retinico è stato coltivato in Medio minimi essenziali di Eagle (MEM, Invitrogen-Gibco-Life Technologies Inc., Rockville, MD), pH 7.4, integrato con 0,2 mg / ml glutammina, 10 mg / ml di insulina suina, 1 piruvato mM, 0,1 mM di acido L-ascorbico, 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, e 250 ng / ml di amfotericina B (antibiotico Antimicotici: Sigma, St. Louis, MO), e aerato con umidificata al 5% di CO _2, aria equilibrio, a 37 ° C. Medio è stato scambiato ogni due giorni.

Tessuti possono essere utilizzati, trattati con una varietà di reagenti o sonde, o non trattata per le successive analisi biochimiche o morfologiche. La sezione seguente descrive le procedure per creare coerente a tutto spessore della retina sezioni.

5. Sezionamento

1. Utilizzando un criostato
   1. Fissare tessuto retinico nel 4% parafomaldehyde notte a 4 ° C;
   2. Sciacquare brevemente tessuto con tampone fosfato (PBS);
   3. Rimuovere con attenzione il tessuto dalla carta da filtro mentre è in PBS in un piatto da 35 mm utilizzando un microscopio a dissezione;
   4. Trasferimento di tessuto al 30% di saccarosio e mantenere una notte a 4 ° C;
   5. Aspirazione via la soluzione in eccesso intorno al tessuto, aggiungere sufficiente Tissue-Tek medio (OCT Compound 4583) per coprire i tessuti, e lasciare in ammollo a temperatura ambiente per 2 ore di permeare il tessuto;
   6. Costruire una cornice quadrata (10 mm x 10 mm, 5 mm di altezza) con impronte dentarie e mettetelo in tutto il tessuto; aggiungere più Tissue-Tek medio per riempire il fotogramma (assicurarsi che il campione di tessuto è piatto) e mettere in un freezer (- 20 ° C) per almeno 1 ora;
   7. Trasferire il blocco congelato campione ad una piattaforma campione (assicurarsi che il blocco del campione è verticale alla piattaforma);
   8. Montare il campione in una piattaforma pre-raffreddata criostato (-20 ° C, Leica, CM1900) e assicurarsi che il blocco è verticale per la lama;
   9. Rimuovere la cera e il blocco di frame prima di sezionare il tessuto di spessore desiderato;
   10. Posizionare le sezioni in gelatina trattati con diapositive.
2. Utilizzando un Vibratome
   1. Fix e lavare il tessuto come sopra descritto per il criostato;
   2. Posizionare il tessuto in pre-riscaldato, agar fuso 4% in un piccolo contenitore e conservare a 4 ° C fino a quando il rapprende agar completamente;
   3. Utilizzare una lama affilata per tagliare l'agar in un piccolo blocco con il campione di tessuto interno;
   4. Incollare il blocco campione su un portacampioni vibratome con Krazy colla (assicurarsi che il pezzo di campione di tessuto è verticale alla piattaforma di secoloe titolare del campione, cioè perpendicolare alla lama) e montare il supporto su un sistema vibratome sezionamento (Leica, serie 1000) con il blocco del campione completamente immersi in acqua ghiacciata;
   5. Tagliare il blocco campione in 50 sezioni micron e disporli sulla gelatina trattati con le diapositive con una spazzola morbida.

6. Immunoistochimica

Utilizza un qualsiasi protocollo standard. Immunolabeled sezioni spesse possono essere visualizzati con un microscopio confocale.

7. Rappresentante dei risultati:

Morfologia è stata preservata durante il periodo di sette giorni di cultura. Le immagini della retina prima e dopo la coltura sono disponibili nel video.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

I ricercatori hanno stabilito una visione varietà di sistemi di coltura della retina, compresi i sistemi organotipica, per studiare una serie di questioni, come il trapianto di cellule staminali della retina ^1, la rigenerazione della retina ^2, e l'espressione genica esogeni ^3-5. Tuttavia, retina dei mammiferi adulti è difficile da mantenere in vitro, principalmente a causa della alte energie richieste dei fotorecettori ^6. Koizumi et al. Descritto un con...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
MEM	Invitrogen-Gibco	10370-021
5 ml puntale	ISC BioExpress	P-3250-19
NUNC cellula inserto cultura	Termico	137443	8μm, Policarbonato
4M filtro di carta Whatman	Whatman	1004
DMEM	Cellgro-Mediatech Inc	10-013-CV
Agar	Fluka	05040
Fungizone amfotericina B	Invitrogen-Gibco	15290018
Trapano lame	Bausch and Lomb	T3096	6,00 millimetri
Ottobre Compound	Electron Microscopy Sciences	62550-01	4583
	Scienze
Criostato	Leica	CM1900
Vibratome	Leica	Serie 1000
Microscopia confocale;	Carl Zeiss	LSM510
Anti-proteina delle vescicole sinaptiche 2 (SV2) anticorpo monoclonale di topo	DSHB	N / A
Anti-proteina acidica fibrillare gliale (GFAP) anticorpo policlonale di coniglio	DAKO	DAKO
Propidio ioduro (PI)	Sigma	P4170