قياس نشاط رابطة الدول المستقلة عناصر التنظيم في الشبكية بواسطة الماوس Electroporation يزدرع

Summary

يصف هذا البروتوكول وسيلة بسيطة وغير مكلفة لقياس نشاط رابطة الدول المستقلة عناصر التنظيم (أي محسن / المروجين) يعيشون في شبكية العين عن طريق الماوس electroporation ازدراع. موصوفة إعداد الحمض النووي ، وتشريح شبكية العين ، electroporation ، ثقافة يزدرع الشبكية ، وبعد التثبيت التحليل النوعي والكمي.

Abstract

عوامل النسخ الجيني داخل شبكات الخليوي السيطرة على نمط spatiotemporal ومستويات التعبير عن الجينات المستهدفة من قبل ملزم لرابطة الدول المستقلة عناصر التنظيم (CREs) ، قصيرة (~ 300-600 بي بي) وتمتد من الحمض النووي الجيني الذي يمكن أن تظل قطاعات المنبع والمصب ، أو في غضون والإنترونات من الجينات التي تسيطر عليها. CREs (أي القدرة على / المروجين) وعادة ما تتألف من مواقع متعددة عنقودية ملزمة لكلا تفعيل النسخي وrepressors ^1-3. انهم بمثابة تكامل منطقي للمدخلات الانتاج النسخي إعطاء الوحدوي في شكل من أشكال النشاط المروج spatiotemporally دقيقة ودقيقة من الناحية الكمية. وقد اعتمدت معظم الدراسات من الثدييات مقرون التنظيم حتى الآن على transgenesis الماوس كوسيلة للمعايرة وظيفة من CREs محسن ^4-5. هذا الأسلوب هو مضيعة للوقت ومكلفة ، وعلى حساب من آثار موقع الإدراج ، إلى حد كبير غير الكمية. من ناحية أخرى ، تم وضع المقايسات الكمية لجنة المساواة العرقية وظيفة الثدييات في نظم زراعة الأنسجة (، على سبيل المثال المقايسات luciferase المزدوج) ، ولكن أهميتها في الجسم الحي من هذه النتائج غالبا ما تكون غير مؤكدة.

Electroporation يقدم بديلا ممتازا لtransgenesis الماوس التقليدي في أنه يسمح كل من التقييم spatiotemporal والكمي لرابطة الدول المستقلة للتنظيم النشاط في الأنسجة الحية الثدييات. وقد كان هذا الأسلوب مفيدا بشكل خاص في تحليل التنظيم رابطة الدول المستقلة في النظام العصبي المركزي ، وخاصة في قشرة الدماغ وشبكية العين ^6-8. بينما electroporation الماوس شبكية العين ، سواء في الجسم الحي وفيفو السابقين ، وقد وضعت وصفه على نطاق واسع بواسطة ماتسودا وCepko ^6-7،9 ، وقد وضعنا مؤخرا مقاربة بسيطة لقياس نشاط مبصرة محددة CREs في شبكية العين الماوس electroporated ^10. بالنظر إلى أن كمية من الحمض النووي التي يتم تقديمها في شبكية العين بواسطة electroporation يمكن أن تختلف من تجربة إلى تجربة ، فمن الضروري أن تدرج "التحكم تحميل' شارك في electroporated في جميع التجارب. في هذا الصدد ، والتقنية هي مشابهة جدا لفحص وluciferase المزدوجة المستخدمة لقياس النشاط المروج في الخلايا المستزرعة.

عندما يعاير مبصرة مقرون التنظيم النشاط ، تتم عادة في الفئران حديثي الولادة electroporation (يوم بعد الولادة 0 ، P0) وهو وقت الذروة انتاج قضبان ^11-12. مرة واحدة أنواع الخلايا الشبكية تصبح بعد الإنقسامية ، electroporation هو أقل بكثير من الكفاءة. نظرا لارتفاع معدل الولادات في الفئران حديثي الولادة قضبان وعيدان من أن تشكل أكثر من 70 ٪ من الخلايا في شبكية العين الماوس الكبار ، وغالبية الخلايا التي يتم electroporated في P0 وقضبان. لهذا السبب ، قضيب مبصرات هي أسهل نوع من الخلايا الشبكية للدراسة عبر electroporation. تقنية وصفنا هنا هو مفيد في المقام الأول لقياس نشاط CREs مبصرة.

Protocol

1. بناء غرفة electroporation

1. نظام microslide ، BTX الموديل 453 مع وجود فجوة 3.2mm (هارفارد جهاز # 45-0105) (الشكل 2A). يجب أن تكون قضبان معدنية مغلقة تماما في الجزء السفلي من الشريحة.
2. استخدام أداة DREMEL لخفض مؤشر قبالة الرف microcentrifuge أنبوب من البلاستيك. خفض المقبض إلى قطع مستطيلة صغيرة كل 5 مع الأبعاد التالية : طول 0.8cm ، 0.6cm الارتفاع ، 0.3cm عرض (الشكل 2B). هذه القطع البلاستيكية التي يعاد استخدامها هي الفواصل التي سيتم استخدامها لقالب الآبار الفردية في غرفة microslide.
3. إدراج الفواصل البلاستيكية بين القضبان المعدنية لmicroslide على فترات حتى. وينبغي أن الفواصل تناسب بشكل مريح (الشكل 2C).
4. قطع رأس قبالة الطرف ماصة P200 ، صالح طرف على حقنة 3ml ، وملء المحقنة مع 100 ٪ سيليكون المطاط تسرب ماء. سد الفجوات بين الفواصل البلاستيكية مع تسرب. تأكد من ملء الفجوات من الأسفل حتى تصل أنه لا يوجد شكل فقاعات بين قابس وتسرب قاعدة microslide.
5. وضع قضيب معدني على قمة الفواصل البلاستيكية وربط ذلك مع لقطات الموثق ، بحيث يتم عقد الفواصل في المكان في حين يجف تسرب (الشكل 2D - E). السماح لتسرب الجافة بين عشية وضحاها.
6. إزالة مقاطع الموثق ، قضيب معدني ، والفواصل البلاستيكية (الشكل 2F). استخدام شفرة المشرط لتنظيف تسرب قبالة الجزء العلوي من القضبان المعدنية. استخدام المجهر لدراسة تشريح microslide وضمان عدم وجود فقاعات موجودة في الجزء السفلي من السدود السيليكون. إزالة أي مانع أن الفيلم قد تشكلت في تلك الآبار التي يتعرض المعدن داخل الآبار. ملء أحد جيدا مع الماء والتأكد من أن المياه لا تتسرب إلى البئر المجاور (ق). أكرر للجميع الآبار.
7. وأنهى microslide تناسبها في طبق من البلاستيك مع أقطاب معدنية بجوار النافذة في جانب من الصحن (الشكل 2G) ؛ في نهاية المطاف سوف تكون الأقطاب التي تعلق على أعمدة معدنية.

2. إعداد DNA

1. إضافة DNA البلازميد لأنبوب microcentrifuge 1.5mL على الجليد ، وتقديم ما يصل الى حجم 150μl بالماء المقطر. ويمكن الجمع بين أنواع متعددة للبلازميد electroporation المشترك (على سبيل المثال ، وبناء التجريبية DsRed وبناء GFP التحكم). عند حساب كمية من الحمض النووي لإضافة إلى أنبوب ، ونأخذ في الاعتبار أن الحجم النهائي للقسامة الحمض النووي سيكون 60μl. عادة ، يتم استخدام كل بناء في التركيز النهائي لل0.5μg/μl.
2. ترسيب الحمض النووي عن طريق إضافة 15μl خلات الصوديوم 3M (5.2 درجة الحموضة) و450μl الإيثانول بنسبة 100 ٪. المقلوب أو استغلال الانبوب عدة مرات الى المزيج.
3. تدور باستمرار على الحمض النووي في 4 درجات مئوية ، 13200 دورة في الدقيقة ، لمدة 30 دقيقة. غسل بيليه مع الايثانول 70 ٪ ، ثم تدور عليه مرة أخرى في 4 درجات مئوية ، 13200 دورة في الدقيقة ، لمدة 15 دقيقة. الهواء الجاف بيليه حتى شبه شفافة ، حوالي 7 دقائق ، ثم resuspend في الماء المعقم 54μl. إضافة 6μl PBS 10X العقيمة (7.4 درجة الحموضة) ومزيج.

3. جمع العين

1. تعقيم الغرفة ، وجميع الصكوك electroporation مع الايثانول 70 ٪. في حين جمع تشريح العين وليس من الضروري أن يقوم في نسيج غطاء الثقافة وتطهير القفازات الخاصة بك والفوق مع الإيثانول ومحاولة للحفاظ على ظروف معقمة في جميع أنحاء الداخلي.
2. إعداد أطباق بتري مع تشريح المتوسطة (1:1 نسبة DMEM : F12 ، 100U/ml البنسلين ، الستربتوميسين 100μg/ml ، 0.29mg/ml L - الجلوتامين ، والانسولين 5μg/ml) : اثنان 35mm الأطباق مع كل واحدة متوسطة 3ml 60mm الطبق مع 6ml المتوسطة. يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة في نسيج الثقافة هود.
3. تطهير الرأس والعنق لحديثي الولادة (يوم بعد الولادة 0) الجرو الفأر مع الايثانول 70 ٪. قطع رأس بسرعة مع مقص ، ونقل رئيس لطبق 100mm العقيمة.
4. قطع بعيدا عن فروة الرأس مع مقص صغير لكشف العينين. استخدام ملقط لحلج القطن بلطف منحني العين للخروج من المدار ، ومكان العين في صحن يحتوي على 35mm المتوسطة تشريح. قد يكون من المفيد لإزالة العيون تحت المجهر في تشريح منخفضة الطاقة.
5. كرر الخطوات من 3.3 و 3.4 حتى الانتهاء من جمع كل العيون. يبقي عينيه في تشريح المتوسطة في درجة حرارة الغرفة بينما تشريح. ستحتاج عيون 3-4 في قسامة الحمض النووي.

4. تشريح الشبكية

1. استخدام الإيثانول بنسبة 70 ٪ لتطهير كل من شفرة حلاقة ومجمع للنقل ماصة بلاستيكية معقمة. قطع رأس قبالة ماصة مع النصل بحيث أنه يمكن أن تمتص العين كلها. ماصة تخزين في مجمع البلاستيك عندما لا تكون قيد الاستعمال.
2. نقل عين واحدة من الطبق إلى صحن 35mm 60mm. تحت المجهر تشريح في الطاقة العالية ، واستخدام الملقط لإزالة أي غرامة الأنسجة ، مثل العضلات والدهون خارج المقلة ، من على سطح العين. ثم ، إزالة العصب البصري بواسطة معسر تشغيله في القاعدة.
3. من أجل عزل شبكية العين ، كزة حفرة صغيرة طن الصلبة في حوف. إدراج أحد الشق من كل زوج من الملقط في الحفرة (عرضية على سطح الشبكية) ، والمسيل للدموع بلطف فتح الصلبة / RPE. في الفئران البيضاء ، والصلبة وRPE تظهر النسبية لامعة للأنسجة الشبكية ، والذي هو لون الرمادي ماتي متجانسة. في الفئران مصطبغة ، وRPE سوداء. ترك العدسة في مكانها.
4. استخدم ماصة نقل لنقل تشريح الشبكية في الطبق 35mm أخرى مع المتوسط.
5. كرر الخطوات من 4،2-4،4 حتى يتم تشريح كل العيون.
6. تخزين شبكية العين في 37 درجة مئوية الأنسجة حاضنة الثقافة حتى تكون على استعداد لelectroporate.

5. استعدادا لelectroporation

1. إعداد أطباق 35mm من المتوسط. لكل قسامة الحمض النووي ليكون electroporated ، وسوف تحتاج طبق واحد من تشريح والمتوسطة طبق واحد من الثقافة المتوسطة (متوسطة تشريح زائد 10 ٪ FBS). تسمية الأطباق بشكل مناسب.
2. استخدام ماصة P200 ومعقمة PBS 1X لغسل خارج الغرف في صحن electroporation. كل غرفة يحمل حجم 100μl - 60. تغسل كل غرفة ثلاث مرات.
3. ملء الغرف مع aliquots الحمض النووي. ينبغي أن تملأ الغرف غير المستخدمة مع أي 60μl 1X PBS. توصيل الأقطاب الكهربائية إلى صحن electroporation.
4. استخدام الإعدادات التالية على electroporator : الوضع ، والوقف ؛ الجهد ، 30V ، ومدة النبضة ، 50 مللي ثانية ، وعدد من البقول ، و 5 ؛ الفاصل ، 950 مللي ثانية ؛ القطبية ، أحادية القطب.

6. Electroporation

1. استخدام ملقط غرامة لفهم شبكية العين بواسطة العدسة ونقلهم الى غرف electroporation. كل غرفة يحمل ما يصل الى شبكية العين الماوس 3-4 (الشكل 3).
2. استخدام ملقط ليصطف في شبكية العين مثل هذه العدسة يميل ضد قضيب معدني تعلق على القطب الموجب. تنظيف ملقط مع Kimwipe بعد كل عملية نقل لتجنب المرحل من الحمض النووي من غرفة إلى أخرى.
3. حالما يتم محاذاة كل شبكية العين ، اضغط على "ابدأ" على electroporator. وينبغي أن فقاعات صغيرة على شكل قضيب معدني تعلق على القطب السالب.
4. قطع الأقطاب وإيقاف electroporator.
5. استخدام ملقط لتحريك بلطف شبكية العين بعيدا عن جدران الغرفة.
6. استخدام ماصة نقل معقمة لنقل شبكية العين من الغرف في الأطباق التي تحتوي على 35mm المتوسطة تشريح.
7. تغسل كل غرفة ثلاث مرات مع 1X PBS معقمة ، ثم تشطف بالماء المعقم. رذاذ الطبق مع الايثانول 70 ٪.

7. وضع الفلاتر على شبكية العين للثقافة

1. استخدام ماصة نقل لنقل شبكية العين في الأطباق التي تحتوي على 35mm متوسطة الثقافة.
2. تسمية آبار لوحة الثقافة العقيمة 6 - جيدا وملء كل جيدا مع مستنبت 3ml.
3. استخدام ملقط معقم لوضع الفلاتر الجولة Whatman Nuclepore ، جنبا لامعة فوق ، فوق المتوسط ​​في كل بئر.
4. تشريح تحت المجهر ، واستخدام ماصة نقل معقمة لنقل شبكية العين على التصفية ، أسفل عدسة الجانب. إذا كانت الأراضي الشبكية عدسة جانب المتابعة ، يستلم السلعة مع ماصة ومحاولة وضعها مرة أخرى. لا تضع أكثر من 4 شبكية العين على مرشح واحد ، وتأكد من أن قطرات من الوسط المحيط الشبكية تبقى منفصلة لكل من قطرات أخرى. علما بأننا الثقافة الشبكية سليمة مع عدسة ، على الرغم من البروتوكولات الأخرى الدعوة لإزالة العدسة قبل هذه الخطوة ^9.
5. وضع الثقافة في لوحة 37 درجة مئوية نسيج الثقافة الحاضنة (5 ٪ CO ₂₎ وتنمو عن المبلغ المطلوب من الزمن ، عادة ثمانية ايام. في تجربتنا ، وتغيير وسيلة لا لزوم لها خلال الفترة من يوم الثقافة الثمانية ، رغم أنه قد تكون هناك حاجة إلى تغيير المتوسطة لفترات أطول الثقافة.

8. الحصاد وflatmounting explants الشبكية الفلورسنت

1. استبدال المتوسطة الثقافة في كل بئر مع بارافورمالدهيد 4 ٪ / 1X PBS. إذا لا تزال عالقة في شبكية العين للمرشحات ، واستخدام ملقط لقلب أكثر المرشحات وبلطف قشر شبكية العين قبالة التصفية. في احتضان بارافورمالدهيد لمدة 30 دقيقة. في درجة حرارة الغرفة. حماية شبكية العين من الضوء لتجنب تبيض مضان.
2. شطف شبكية العين لمدة 10 دقائق مرتين في برنامج تلفزيوني 1X.
3. استخدام ماصة المتاح لنقل شبكية العين على شريحة زجاجية في قطرة صغيرة من برنامج تلفزيوني. تحت المجهر الفلورسنت تشريح ، واستخدام ملقط لقلب شبكية العين بحيث تكون electroporated جانب الهاتفي (أي عدسة الجانبية لأسفل).
4. مكان الزجاجي "قدم" مصنوع من coverslips سحقت (شظايا الزجاج حوالي 1-2 مم في القطر) في زوايا الشريحة ، وهذه أقدام منع تسطيح للشبكية. وضع علامة ساترة الزجاج سليمة على الشريحة بحيث تغطي شبكية العين ، وتقع على القدمين. إذا كان ذلك ضروريا ، واستخدام ماصة لإضافة المزيد من PBS بين الشرائح وساترة ل.

9. التصوير والكمي لمضان في flatmount

1. استخدامفلوري المجهر المركب مجهز بكاميرا لصورة أحادية اللون شبكية العين flatmounted في الطاقة المنخفضة (الهدف 4X) في القنوات الأحمر والأخضر. يجب تصوير كل شبكية العين مع الوقت تعرض نفسها لقناة الفلورسنت نظرا لتمكين المقارنة بين شدة مضان. تأكد من أن لا تشبع بكسل في أي صورة ، وإلا الكمي الدقيق سيكون من المستحيل. لوحات التصدير في الرمادي تنسيق TIFF.
2. فتح الصورة مجموعة واحدة شبكية العين (أي.. والقناة الأحمر وقناة خضراء) في مجال البرمجيات ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ). من أجل هذا البرنامج التعليمي ، قناة خضراء فلوري (GFP البروتين) هو بناء التحكم الذي هو ثابت في كل شبكية العين في التجربة. القناة الحمراء الفلورسنت (بروتين DsRed) هو بناء التجريبية التي تختلف عن كل مجموعة من شبكية العين. ينبغي أن تكون الصور في الرمادي.
3. في ImageJ ، حدد الصورة السيطرة الخضراء وتحديد المصالح مع دائرة قطرها 100 وحدة (تحليل / أدوات / مدير ROI / عن / حدد). تكرار هذه الدائرة (ROI مدير / إضافة) لإنشاء eight مجموع الدوائر. تحرك الدوائر 1-5 لتحديد خمس مناطق التي electroporated موحد ، وتجنب الحواف الخارجية لشبكية العين والمنطقة التي تغمر عدسة (الشكل 4A). أيضا ، حدد ثلاث مناطق (دوائر 6-8) خارج شبكية العين / العدسة لقياس مضان الخلفية. حدد صورة حمراء ، إلغاء الاختيار "إظهار كافة" مربع في إدارة عائدات الاستثمار ، وإعادة فحص مربع. ينبغي لجميع الدوائر eight تظهر على صورة الحمراء. دي اختيار كل مدير دائرة الإحداثيات في العائد على الاستثمار.
4. مع صورة مختارة الحمراء ، سجل القيمة بكسل يعني بالنسبة لجميع الدوائر ذات الاهتمام (ROI / مدير قس) ؛ القياسات يجب أن تظهر 1-8 ، 1-5 ، حيث هي قياسات الحمراء الشبكية و 6-8 هي قياسات خلفية حمراء. حدد الصورة الخضراء وتسجيل قيمة بكسل يعني ؛ القياسات 9-16 يجب أن تظهر ، حيث 13/09 هي القياسات الخضراء الشبكية و 14-16 هي قياسات خلفية خضراء. نسخ بيانات القياس إلى Excel للتحليل (الشكل 5).
5. متوسط ​​القياسات الثلاثة في الخلفية الحمراء على حد سواء ، وقنوات خضراء. طرح متوسط ​​خلفية حمراء من كل القياسات five الشبكية في القناة الحمراء ؛ تكرار للقناة خضراء. لكل الشبكية المنطقة الفائدة من وتقسيم الخلفية الحمراء التي تطرح قياس قياس الخلفية الخضراء تطرح من أجل تطبيع على المستوى التجريبي إلى المستوى الأحمر السيطرة الخضراء (الشكل 5).
6. تحديد الانحراف المتوسط ​​ومستوى جميع القياسات طبيعية لبناء DsRed معين (مثلا ، 5 مرات في القياسات شبكية العين شبكية العين 3 منفصلة). من أجل مقارنة كميا نتائج electroporations نفذت في أيام مختلفة ، تشمل دائما "قياسي" DsRed هطول الأمطار / GFP في كل مجموعة electroporation. ويمكن مقارنة القيم النسبية التعبير عبر التجارب التي تطبيع إلى مستوى التعبير عن هذا "المعيار".

10. ممثل النتائج :

A electroporation النتائج الجيدة في التعبير عن بناء الحمض النووي (ق) في 1 / 4 الى 1 / 3 من سطح الشبكية (الشكل 4A). حيث يتم بكفاءة وبخاصة قضيب مبصرات transduced ، وهذا الأسلوب هو الأمثل لقياس النشاط مبصرة محددة المروج (الشكل 4B). كنا في وقت سابق هذا النهج لتحديد مجموعة من المتغيرات المروج من رو قضيب مواضع محددة وGnat1 ^10. وجدنا أنه من الممكن لقياس النشاط المروج على مسافة 300 أضعاف تقريبا.

الرقم 5 هو عينة من مجموعة بيانات الشبكية a electroporated واحد. في هذا المثال وجه الخصوص ، تم قياس التجريبية بناء pNrl (1.1kb) - DsRed في القناة الحمراء وقياس التحكم بناء pNrl (3.2kb) - GFP في قناة خضراء. ومن شأن مجموعة بيانات كاملة لpNrl (1.1kb) - DsRed بناء تتكون من شبكية العين 6-9 تقاس بهذه الطريقة ، وسوف يتم احتساب قيمة الانحراف المعياري استنادا إلى جميع "لتطبيع DsRed GFP" القيم. إذا قارنا مستوى التعبير عن pNrl (1.1kb) - DsRed ، على سبيل المثال ، pNrl (0.8kb) - DsRed ، ثم يبني على حد سواء يجب أن يتم مع مراقبة electroporated GFP نفسه (على سبيل المثال ، pNrl (3.2kb) -- GFP) وتصويرها في الأوقات تعرض نفسها. فمن الممكن أن تجمع البيانات التي تم جمعها في أيام مختلفة إذا كان معيار DsRed / GFP electroporation يتم تنفيذ كل يوم (على سبيل المثال ، pNrl (3.2kb) - dsRed + pNrl (3.2kb) - GFP). لكل بناء التجريبية ، فإن في وقت لاحق على مستوى تطبيع DsRed يكون لتطبيع مستوى DsRed تطبيع من "المعيار" (pNrl (3.2kb) - dsRed).

تقنية وصفنا هنا هو مفيد في المقام الأول لقياس نشاط CREs مبصرة ^10،13.ويمكن أيضا خلية نوع محدد للتنظيم نشاط رابطة الدول المستقلة يمكن قياسها كميا ، في أندر أنواع الخلايا مثل خلايا الشبكية ¹⁴ القطبين ، ولكن هذا عادة ما يتطلب أن يكون اختيار المجالات التي تهم يمكن قياسها كميا ، في المقاطع العرضية الرأسية بدلا من الاستعدادات flatmount. وينطبق الشيء نفسه على CREs التي تدفع التعبير في أنواع خلايا متعددة مثل خلايا المستقبلات الضوئية وثنائي القطب. إجراءات تجريبية مماثلة خلاف ذلك.

الشكل 1. نظرة عامة على الإجراء يزدرع electroporation الشبكية. وعزله للمرة الأولى ، وعيون كل من الجراء يوم بعد الولادة 0 الماوس وتشريح شبكية العين (P1). ثانيا ، يتم وضع شبكية العين في غرف مليئة الحمض النووي وelectroporated (P2). الثالث ، يتم وضع شبكية العين على المرشحات وتربيتها لمدة ثمانية أيام (P3). الرابعة ، هي ثابتة explants الشبكية ، التي شنت على الشرائح ، وتصويرها. ويتم قياس كثافة مضان مع برنامج ImageJ (P4). الخامسة ، تتم معالجة البيانات ImageJ في برنامج جدول بيانات لقياس الفرق في نشاط المروجين المختلفة (P5).

الشكل 2. تشييد الطبق electroporation. أ) غرفة microslide معدلة من جهاز هارفارد ، BTX طراز 453 (كتالوج # 45-0105). ب) يستخدم أداة DREMEL لقطع التعامل مع قبالة رف أنبوب من البلاستيك. هو خفض مؤشر إلى الفواصل مستطيلة مع الأبعاد التالية : طول 0.8cm ، 0.6cm الارتفاع ، 0.3cm العرض. ج) يتم تركيبها والفواصل البلاستيكية في الغرفة microslide على فترات متساوية. يتم حقن الحوض تسرب في الفجوات بين الفواصل (لا يظهر). D) يتم وضع قضيب معدني خلال الفواصل. E) وفرضت شريط والفواصل على الشريحة مع مقاطع الموثق لعقد كل شيء في مكانه كما أن يجف تسرب بين عشية وضحاها. F) تتم إزالة الفواصل ويتم اختبار الآبار لضمان أن تكون للماء. G) الشريحة الانتهاء يلائم طبق من البلاستيك مع قضبان معدنية بجوار النافذة في جانب الطبق.

الشكل 3. رسم تخطيطي للطبق electroporation مع شبكية العين. تمتلئ غرف مع حلول الحمض النووي (ما يصل إلى خمسة حلول مختلفة في كل مرة). وتوضع في غرف شبكية العين وموجهة بحيث عدسة يميل ضد قضيب معدني متصلا القطب الموجب ، وثلاثة أو أربعة شبكية العين سيكون مناسبا في كل دائرة من الدوائر الخمس. والتيار الكهربائي يتسبب في جزيئات الحمض النووي المشحونة سلبا على التحرك في خلايا الشبكية.

الشكل 4. A قياس ImageJ) من المستويات في flatmount مضان الشبكية. الصور الرمادية flatmount في DsRed (التجريبية) ، ويتم فتح GFP (السيطرة) في برنامج قنوات ImageJ ، علما أنه تم الملونة هذه الصور لأغراض توضيحية فقط. توضع الدوائر الخمس القياس (1 إلى 5) على مناطق electroporated موحد ، وتجنب حواف والعدسة (الخطوط المنقطة). توضع دوائر القياس الثلاث (من 6 إلى 8) خارج شبكية العين لتحديد مستويات مضان الخلفية. B) مستعرضة صورا لشبكية العين يزدرع an electroporated على الطاقة العالية. تم إصلاح يزدرع في يوم ما بعد الولادة 8 ، في برنامج تلفزيوني cryoprotected sucrose/1X 30 ٪ بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية ، وجزءا لا يتجزأ من أكتوبر ، والبرد في 12μm مقطوع. وأعرب عن الفلورسنت يبني pNrl (1.1kb) - DsRed وpNrl (3.2kb) - GFP في خلايا مستقبلة للضوء في طبقة النووية الخارجي (y. قل). ، طبقة داخلية INL النووية ؛ GCL ، طبقة الخلايا العقدية.

الشكل 5. تجهيز البيانات باستخدام Excel مضان. في الخطوة 1 ، يتم نسخ القيمة بكسل يعني كل دائرة لقياس في جدول (الخلايا B3 - B12 ، F3 - F5 ، H3 - H5). # 1-5 القياسات هي القيم DsRed الشبكية و # 6-8 هي القيم الأساسية DsRed ؛ القياسات # 9-13 هي القيم GFP الشبكية و# 14-16 هي القيم الأساسية GFP. علما بأن القياس رقم 1 ورقم 9 تتوافق مع دائرة القياس نفسه ، كما يفعل القياسات # # 2 و 10 ، وهلم جرا. في الخطوة 2 ، يتم حساب متوسط ​​قيمة الخلفية للقنوات وDsRed GFP (الخلايا F6 ، H6). في الخطوة 3 ، هو مطروح على خلفية كل من متوسط ​​قياس الشبكية (خلايا C3 - C12). في الخطوة 4 ، ولكل الخلفية طرح هو تطبيع قياس DsRed لقياسه GFP المقابلة (الخلايا D3 - D7).

Discussion

يزدرع electroporation هي وسيلة بسيطة لقياس نشاط رابطة الدول المستقلة التنظيم في الشبكية الماوس النامية. بالمقارنة مع بلدان رابطة الدول المستقلة ، عن طريق تحليل تنظيمي transgenesis الماوس ، electroporation أرخص بكثير ، وتتطلب الجراء الوليد الماوس فقط ، الحمض النووي ، وأدوات تشريح ، وelectroporation / الأنسجة معدات الثقافة. كما أنها تستهلك وقتا أقل بكثير : تجربة واحدة يتطلب سوى بضع ساعات من وقت الإعداد ، وهي فترة ثقافة حوالي ثمانية أيام ، وبعد ساعات قليلة على نهاية التجربة لتصوير وتحليل البيانات. يزدرع electroporation أيضا متفوقة على تحليل الخلية التنظيمية لرابطة الدول المستقلة ، القائمة على الثقافة منذ يستخدم أنسجة الشبكية الفعلية. يتطور عادة في الشبكية تماما في يزدرع الثقافة أنها تشكل ثلاث طبقات خلوية مختلفة (الطبقة النووية الخارجي ، وطبقة داخلية النووية ، وطبقة الخلايا العقدية) ، على الرغم من فشل مبصرات لوضع شرائح الخارجي.

وثمة ميزة أخرى هي أن يتم استنساخه electroporation ازدراع للغاية. ويبني نفسه في شبكية العين electroporated مختلفة ، حتى في أيام مختلفة ، والنتائج عادة في مستويات التعبير النسبي نفسه. وعلاوة على ذلك ، حيث يعتقد أن البلازميدات electroporated إلى الإبقاء episomally في النواة وليس دمجها في الصبغيات (الكروموسومات) ، فإنها لا تبدو خاضعة لتأثيرات التكامل نفس الموقع الذي يبتلي مقرون التنظيم التحليل التي أجريت في الفئران المعدلة وراثيا.

يزدرع electroporation لديه العديد من القيود. أولا ، يمكن فقط الخلايا التي لا تزال في دورة الخلية transduced بكفاءة electroporation ^15. في P0 ، وقضبان وغيرها في وقت لاحق من مواليد أنواع الخلايا الشبكية (خلايا القطبين ، والخلايا عديم الاستطالات ، M ller الدبقية) هي الخلية الرئيسية المستهدفة من السكان بواسطة هذه الطريقة. وقد أبلغ Electroporation من مبصرات مخروط بواسطة P0 electroporation ¹⁶ ولكن يبدو أن الكفاءة المنخفضة. والقيد الثاني هو أن الثقافة يزدرع تتجاوز اسبوعين في نتائج تشوه التدريجي لشبكية العين وبالتالي لا يوصى. إذا كان مطلوبا الكمي المروج timepoints في وقت متأخر ، ومع ذلك ، قد يتم تنفيذ في electroporation فيفو ⁹ ، تليها تشريح الشبكية في timepoint المطلوب ، مسطحة المتصاعدة من تشريح شبكية العين ، وتقدير كما هو موضح في الباب 9. والقيد الثالث هو أن هذا الاختبار هو فقط معتدلة الإنتاجية العالية. خلافا المقايسات القائمة على الثقافة الخلية التي يمكن اختبار المئات من يبني في تجربة واحدة ، وتقنية وصفها في هذا البروتوكول يتطلب حدا أدنى من أحد الشبكية الماوس كله في بناء. وبالتالي ، يمكن معقول فقط بضع عشرات من أن يبني electroporated في يوم واحد.

التحذير واحدة إضافية فيما يتعلق الكمي للنشاط المروج باستخدام النهج الحالي هو ان هناك امكانية ل"ينزف من خلال" لمضان DsRed في القناة GFP ، ولا سيما عندما يعاير المروجين قوي جدا. والسبب في ذلك هو أن الطيف انبعاث DsRed التي تتداخل جزئيا من GFP. للتحايل على هذه المشكلة ، يجب استخدام الفلاتر التي تقلل من الانبعاثات الأمثل للتداخل بين الأطياف وDsRed GFP. عندما يكون هذا المرشح الأمثل مجموعات غير متوفرة ، فإن احتمال حل آخر يتمثل في استخدام البروتين الزرقاء تحول الفلورسنت (على سبيل المثال ، أو BFP CFP) بدلا من GFP.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد	تعليقات (اختياري)
طبق Electroporation ، Microslide 453	BTX جهاز هارفارد	45-0105	انظر القسم 1 لبروتوكول التعديلات
100 ٪ سيليكون المطاط الاسمنت الحوض	Perfecto التصنيع
البلاستيك microtube رف	فيشر العلمية	05-541	ولن تستخدم إلا للتعامل مع رف
DREMEL أداة			لقطع التعامل مع قبالة الرف أنبوب بلاستيكي
DMEM	Gibco / Invitrogen	11965
F12	Gibco / Invitrogen	11765
L-Glu/pen/strep	Gibco / Invitrogen	10378-016	100X تركيز
الأنسولين	سيغما الدريخ	I - 6634	بالنسبة لمخزون 1000X ، resuspend في 5mg/ml في حمض الهيدروكلوريك 5mM تعقيم وتصفية -
FBS	Gibco / Invitrogen	26140-079
830 ECM ساحة الموجة electroporator	BTX جهاز هارفارد
مرشحات Nuclepore	Whatman	110606	25mm ، 0.2μm
نسيج الثقافة الحاضنة			37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO 2
coverslips الزجاج # 1.5	فيشر العلمية	12 - 544E	سميكة 0.16mm
فلوري المجهر المركب مجهز بكاميرا			وينبغي أن تكون الكاميرا أحادي اللون (على سبيل المثال ، اوركا - ER الكاميرا هاماماتسو)
EGFP / تعيين مرشح لDsRed مجهر مركب	صفاء شركة تكنولوجيا	86007	هذا bleedthrough تعيين مرشح يقلل chanenels بين الأحمر والأخضر
ImageJ البرمجيات	المعاهد الوطنية للصحة		http://rsbweb.nih.gov/ij/