כימות של פעילות Cis-Regulatory אלמנטים ברשתית עכבר ידי electroporation Explant

Summary

פרוטוקול זה מתאר דרך פשוטה וזולה לכמת את הפעילות של cis-הרגולציה אלמנטים (כלומר, משפר / היזמים) לחיות הרשתיות העכבר דרך electroporation explant. הכנת ה-DNA, דיסקציה רשתית, electroporation, תרבות explant רשתית, שלאחר קיבוע ניתוח וכימות מתוארים.

Abstract

גורמי שעתוק בתוך רשתות גנים הסלולר לשלוט דפוס spatiotemporal ורמות הביטוי של גנים היעד שלהם באמצעות קשירה cis-הרגולציה אלמנטים (צרס), קצר (~ 300-600 נ"ב) מותח של הדנ"א הגנומי אשר יכול לשקר במעלה הזרם, במורד הזרם, או בתוך אינטרונים הגנים הם שולטים. צרס (כלומר, משפרי / היזמים) בדרך כלל מורכב מרובים אתרי הקישור אשכולות הן activators ו repressors תעתיק ^1-3. הם משמשים אינטגרטורים הלוגי של קלט תעתיק מתן פלט יחידתי בצורה של פעילות האמרגן מדויק spatiotemporally ומדויק כמותית. רוב המחקרים של יונקים cis-תקנה עד כה הסתמכה על transgenesis העכבר כאמצעי assaying משפר את הפונקציה של צרס ^4-5. טכניקה זו זמן רב, יקר, על חשבון תופעות באתר הכנסת, בעיקר לא כמותי. מצד שני, מבחני כמותיים לתפקוד Cre יונקים פותחו מערכות תרבות רקמות (למשל, מבחני בלוציפראז כפול), אבל ב vivo הרלוונטיות של תוצאות אלו היא לעיתים קרובות לא ברור.

Electroporation מציע אלטרנטיבה מצוינת transgenesis העכבר המסורתי בכך שהוא מאפשר גם spatiotemporal הערכה כמותית של פעילות cis-הרגולציה רקמה חיה יונקים. טכניקה זו הייתה שימושית במיוחד בניתוח של רגולציה-cis במערכת העצבים המרכזית, בעיקר בקליפת המוח ואת רשתית ^6-8. בעוד electroporation עכבר הרשתית, הן in vivo לשעבר vivo, פותחה ותיאר בהרחבה על ידי מאטסודה ו Cepko ^6-7,9, פיתחנו לאחרונה גישה פשוטה לכמת את הפעילות של photoreceptor ספציפי צרס ב electroporated עכבר הרשתיות ^10. בהתחשב בכך את כמות ה-DNA כי הוא הציג לתוך הרשתית על ידי electroporation יכול להשתנות מניסוי לניסוי, יש צורך לכלול "טעינה מלאה" שותף electroporated בניסויים בכלל. במובן זה, הטכניקה דומה מאוד assay בלוציפראז כפול המשמש לכמת פעילות הפרומוטר בתאים בתרבית.

כאשר assaying photoreceptor cis-הרגולציה פעילות, electroporation מתבצעת לרוב בעכברים היילוד (יום הלידה 0, P0) המהווה את זמן הייצור מוט שיא ^11-12. ברגע סוגי תאים ברשתית להיות שלאחר mitotic, electroporation הוא הרבה פחות יעיל. לנוכח שיעור גבוה של לידת מוט בעכברים הילוד לבין העובדה מוטות מהוות יותר מ 70% של תאים ברשתית עכבר מבוגר, הרוב המכריע של התאים electroporated ב P0 הן מוטות. מסיבה זו, photoreceptors מוט הם סוג הקלה תא רשתית ללמוד דרך electroporation. הטכניקה שאנו מתארים כאן הוא שימושי בעיקר עבור לכימות פעילות של צרס photoreceptor.

Protocol

1. בנייה של חדר electroporation

1. סדר microslide, BTX דגם 453 עם פער 3.2mm (Apparatus הרווארד # 45-0105) (איור 2 א). מסילות מתכת צריך להיות אטום לחלוטין אל החלק התחתון של השקופית.
2. השתמש בכלי Dremel לחתוך את ידית מתלה microcentrifuge צינור פלסטיק. חותכים את הידית לתוך 5 חתיכות מלבני קטן עם כל הממדים הבאים: אורך 0.8cm, 0.6cm גובה, רוחב 0.3cm (איור 2B). אלו פיסות פלסטיק לשימוש חוזר מפרידי כי ישמש עובש בארות בודדים בתא microslide.
3. הכנס את מפרידי פלסטיק בין פסי המתכת של microslide במרווחים שווים. מפרידי צריכה להתאים בנוחות (איור 2C).
4. חותכים את קצה קצה P200 פיפטה, כדי להתאים את קצה מזרק 3ml, ולמלא את המזרק עם 100% איטום גומי סיליקון האקווריום. מלאו את הפערים בין מפרידי פלסטיק עם חומר איטום. הקפידו למלא את הפערים מלמטה למעלה, כך אין בועות טופס בין התקע איטום ובסיס microslide.
5. מניחים על גבי מוט מתכת מפרידי פלסטיק להדק את זה עם קליפים קלסר, כך מפרידי מוחזקים במקום בעוד איטום מתייבש (איור 2D-E). בואו איטום היבש בין לילה.
6. הסר את הסרטונים קלסר, מוט מתכת, פלסטיק מפרידי (איור 2F). השתמש בלהב סכין המנתחים כדי לנקות את איטום מעל החלק העליון של פסי מתכת. השתמש במיקרוסקופ כדי לבחון את ביתור microslide ולוודא כי אין בועות נמצאים בתחתית של סכרים סיליקון. הסר את כל הסרט איטום שאולי נוצרו בארות כזה מתכת חשופה חשוף בתוך הבארות. מילוי אחד מוכר היטב עם מים לוודא שהמים לא דליפה לתוך הבאר הסמוך (ים). חזור על הפעולה עבור כל בארות.
7. Microslide סיים מתאים בצלחת פלסטיק עם מוטות המתכת סמוך לחלון בצד של המנה (איור 2G); את האלקטרודות יהיה בסופו של דבר להיות מחוברים מוטות המתכת.

2. ה-DNA הכנה

1. הוסף פלסמיד דנ"א לצינור microcentrifuge 1.5mL על הקרח ולהביא את נפח עד 150μl עם מים מזוקקים. מינים פלסמיד מרובים עשוי להיות משולב עבור electroporation משותף (למשל, לבנות DsRed ניסיוניים GFP לשלוט לבנות). בחישוב את כמות ה-DNA להוסיף הצינור, יש לזכור כי נפח aliquot הסופי של ה-DNA יהיה 60μl. בדרך כלל, לבנות כל משמש בריכוז הסופי של 0.5μg/μl.
2. להאיץ את ה-DNA על ידי הוספת 15μl נתרן אצטט 3M (pH 5.2) ו - 100% אתנול 450μl. היפוך או ברז הצינור מספר פעמים כדי לערבב.
3. ספין מטה את ה-DNA ב 4 ° C, 13,200 סל"ד, במשך 30 דקות. שטפו את הכדור עם אתנול 70%, אזי ספין אותו שוב ב 4 ° C, 13,200 סל"ד, במשך 15 דקות. אוויר יבש גלולה עד שקופה למחצה, כ -7 דקות, resuspend אז מים סטריליים 54μl. הוסף 6μl PBS 10X סטרילי (pH 7.4) ומערבבים.

3. עין אוסף

1. לחטא את החדר electroporation וכל המכשירים עם אתנול 70%. בעוד אוסף העין לנתיחה לא צריך להתבצע במנדף בתרבית רקמה, לחטא את הכפפות שלך benchtop עם אתנול ניסיון לשמור על תנאים סטריליים לאורך ההליך.
2. הכינו צלחות פטרי עם המדיום דיסקציה (1:1 יחס של DMEM: F12, 100U/ml לפניצילין, סטרפטומיצין 100μg/ml, 0.29mg/ml L-גלוטמין, ואינסולין 5μg/ml): שני 35mm מנות כל אחד עם בינוני 3ml אחד צלחת עם 60 מ"מ בינוני 6ml. צעד זה אמור להתבצע במנדף בתרבית רקמה.
3. לחטא את הראש והצוואר של הרך הנולד (יום הלידה 0) עכבר הגור עם אתנול 70%. במהירות לערוף במספריים ולהעביר את הראש לצלחת 100mm סטרילית.
4. לחתוך את הקרקפת עם מספריים קטנים לחשוף את העיניים. שימוש במלקחיים מעוקל בעדינות כדי לגרוף את העין אל מחוץ למסלול, והמקום עין בצלחת 35mm המכיל בינוני לנתיחה. זה עשוי להיות מועיל כדי להסיר את העיניים תחת מיקרוסקופ לנתח בהספק נמוך.
5. חזור על שלבים 3.3 ו - 3.4 עד שכל העיניים כבר נאספו. לשמור את העיניים במדיום לנתיחה בטמפרטורת החדר תוך ביתור. יהיה עליך בעיניים 3-4 לכל aliquot DNA.

4. רשתית לנתיחה

1. השימוש באתנול 70% לחטא גם סכין גילוח וגם את העטיפה של העברת פיפטה סטרילית פלסטיק. חותכים את קצה פיפטה עם להב כך שניתן להתחנף עין כולה. חנות פיפטה בעטיפה הפלסטיק כאשר אינו בשימוש.
2. העברת עין אחת מצלחת לצלחת 35mm 60mm. תחת המיקרוסקופ לנתח בהספק גבוה, בסדר להשתמש במלקחיים כדי להסיר כל רקמות, כמו שרירים ושומן extraocular, מפני השטח של העין. לאחר מכן, להסיר את עצב הראייה על ידי צובט אותו בבסיס.
3. על מנת לבודד את הרשתית, לתקוע חור קטן אניn בלובן העין בבית לימבוס. להוסיף אחת שיניים משני זוגות מלקחיים לתוך החור (משיק למשטח רשתית) בעדינות דמעה לפתוח את בלובן העין / הרשתית. בעכברים לבקנים, בלובן העין ועל הרשתית מופיעים יחסית מבריק לרקמת הרשתית, שהינה צבע אחיד אפור מט. בעכברים פיגמנט, הרשתית הוא שחור. השאירו את העדשה במקום.
4. השתמש פיפטה להעביר להעביר את הרשתית גזור לתוך צלחת 35mm אחרים בינוני.
5. חזור על שלבים 4.2-4.4 עד שכל העיניים היו גזור.
6. אחסן את הרשתיות ב 37 ° C תרבות רקמות החממה עד שאתה מוכן electroporate.

5. הכנה electroporation

1. הכינו מאכלים 35mm של המדיום. במשך כל aliquot DNA להיות electroporated, תצטרך צלחת אחת של המדיום לנתיחה אחד צלחת של המדיום תרבות (בינוני לנתיחה בתוספת 10% FBS). לייבל את הכלים כראוי.
2. השתמש פיפטה P200 וסטרילי 1X PBS לשטוף את לתאי בצלחת electroporation. כל תא בעל נפח של 60 100μl. לשטוף את כל החדר שלוש פעמים.
3. ממלאים את חדרי עם aliquots DNA. כל החדרים שאינם בשימוש צריך להיות מלא עם 60μl 1X PBS. חיבור אלקטרודות בצלחת electroporation.
4. השתמש בהגדרות הבאות על electroporator: במצב LV, מתח, 30V, אורך הפולס, 50 msec, מספר פעימות, 5; מרווח, 950 msec, קוטביות, חד קוטבי.

6. Electroporation

1. שימוש במלקחיים בסדר לתפוס את הרשתיות של העדשה ולהעבירם לתאי electroporation. כל תא מחזיק עד 3-4 עכבר הרשתית (איור 3).
2. שימוש במלקחיים לקו את הרשתיות כך העדשה נשען על מוט המתכת המחובר האלקטרודה החיובית. נקו את מלקחיים עם Kimwipe לאחר העברת כל להימנע לשאת על ה-DNA מתא אחד למשנהו.
3. לאחר כל הרשתיות מיושרים, לחץ "התחל" על electroporator. בועות זעירות צריך טופס בסרגל מתכת המחובר האלקטרודה השלילית.
4. נתק את אלקטרודות לכבות את electroporator.
5. שימוש במלקחיים להזיז בעדינות את הרשתיות הרחק קירות החדר.
6. השתמש להעביר פיפטה סטרילית להעביר את הרשתיות של התאים לתוך הכלים 35mm המכיל בינוני לנתיחה.
7. לשטוף את כל החדר שלוש פעמים עם סטרילי 1X PBS, ולאחר מכן לשטוף עם מים סטריליים. תרסיס צלחת עם אתנול 70%.

7. הצבת הרשתיות על מסנני לתרבות

1. השתמש פיפטה להעביר להעביר את הרשתיות לתוך הכלים 35mm המכיל בינוני תרבות.
2. לייבל בארות צלחת 6-גם סטרילי תרבות ומלא כל טוב עם בינוני תרבות 3ml.
3. השתמש מלקחיים סטריליות למקום עגול Whatman מסננים Nuclepore, הצד המבריק למעלה, על גבי מדיום בכל טוב.
4. תחת מיקרוסקופ לנתח, להשתמש פיפטה סטרילית להעביר להעביר את הרשתיות על המסנן, העדשה בצד למטה. אם אדמות הרשתית העדשה בצד למעלה, להרים אותו עם פיפטה ולנסות למקם אותו שוב. אין מקום יותר מ 4 הרשתיות על מסנן אחד, לוודא כי טיפות של המדיום סביב כל הרשתית להישאר נפרדים מן טיפות אחרות. שים לב כי אנו התרבות הרשתית עם העדשה ללא פגע, למרות פרוטוקולים אחרים קוראים להסרת העדשה לפני שלב זה ^9.
5. מניחים את צלחת תרבות 37 ° C רקמה תרבות חממה (5% CO ₂₎ לגדול בסכום הרצוי של זמן, בדרך כלל שמונה ימים. מניסיוננו, שינוי המדיום הוא מיותר במהלך תקופה תרבות יום עבודה בן שמונה, למרות שינוי המדיום עשוי להידרש לתקופות תרבות יותר.

8. קציר flatmounting explants רשתית פלורסנט

1. החלף את המדיום תרבות היטב עם כל paraformaldehyde 4% / 1X PBS. אם הרשתית נשארים תקועים עם מסננים, להשתמש במלקחיים כדי להפוך את המסננים מעל בעדינות לקלף את הרשתיות את המסנן. מדגירים את paraformaldehyde למשך 30 דקות. בטמפרטורת החדר. הגנו על הרשתית מן האור, כדי למנוע הלבנת את הקרינה.
2. שוטפים את הרשתיות פעמיים במשך 10 דקות ב 1X PBS.
3. השתמש פיפטה חד פעמי להעביר את הרשתיות לשקופית זכוכית ירידה קטנה של PBS. תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתח, להשתמש במלקחיים כדי להפוך את הרשתית, כך הם electroporated בצד למעלה (כלומר, העדשה בצד למטה).
4. מניחים זכוכית "רגליים" עשוי coverslips כתוש (רסיסי זכוכית על 1-2 מ"מ קוטר) בפינות של השקופית, הרגליים האלה למנוע השטחת הרשתית. הצב coverslip הזכוכית שלם על המגלשה, כך שהוא מכסה את הרשתית ואת נשענת על הרגליים. במידת הצורך, להשתמש פיפטה להוסיף PBS יותר בין השקופיות לבין coverslip.

9. הדמיה וכימות של הקרינה flatmount

1. השתמשמיקרוסקופ פלואורסצנטי המתחם מצויד במצלמת מונוכרום התמונה ברשתית flatmounted על צריכת חשמל נמוכה (4X אובייקטיבי) בערוצים אדום וירוק. הרשתית חייבים להיות צילמו עם זמן חשיפה זהה עבור ערוץ פלורסנט ניתנה כדי לאפשר השוואה בין עוצמות הקרינה. ודא פיקסלים לא רוויים בתמונה כלשהי, או אחר כימות מדויק יהיה בלתי אפשרי. ייצוא תמונות בגווני אפור בפורמט TIFF.
2. פתח את התמונה על הרשתית להגדיר אחד (כלומר .., ערוץ אדום וירוק ערוץ) ב ImageJ תוכנה ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ). למען הדרכה זו, ערוץ פלואורסצנטי ירוק (GFP חלבון) היא לבנות פקד קבוע על פני כל הרשתית בניסוי. ערוץ ניאון אדום (חלבון DsRed) היא לבנות ניסיוני משתנה עבור כל קבוצה של הרשתית. התמונות צריכות להיות בגווני אפור.
3. ב ImageJ, לבחור את התמונה לשלוט ירוק לציין מעגל של עניין עם 100 יחידות בקוטר (ניתוח / כלים / ROI מנהל / עוד / ציון). שכפל את המעגל (ROI מנהל / הוסף) כדי ליצור eight חוגים מוחלט. העבר החוגים 1-5 כדי לבחור לחמישה אזורים, כי הם electroporated אחיד, הימנעות השוליים החיצוניים של הרשתית ואת האזור שמעל העדשה (איור 4 א). כמו כן, בחר בשלושה אזורים (מעגלים 6-8) מחוץ הרשתית / עדשה כדי למדוד את הקרינה רקע. בחר את התמונה אדום, בלתי לבדוק את "Show all" תיבת ROI מנהל, מחדש את התיבה. כל שמונת מעגלי אמור להופיע בתמונה באדום. דה לבחור כל מעגל קואורדינטות מנהל ההחזר על ההשקעה.
4. עם תמונה אדומה הנבחר, להקליט את הערך פיקסל מתכוון לכל החוגים של עניין (ROI מנהל / מדוד); מדידות 1-8 אמור להופיע שם 1-5 הם מדידות רשתית אדום 6-8 הן מדידות רקע אדום. בחר את התמונה ירוק ולהקליט את הערך פיקסל אומר: מדידות 9-16 אמור להופיע, שם הם 9-13 מדידות רשתית ירוק 14-16 הן מדידות רקע ירוק. העתק את נתוני המדידה לתוך Excel לניתוח (איור 5).
5. ממוצע שלושת רקע המדידות הן אדומות ערוצי ירוק. הפחת הממוצע רקע אדום אחד מחמשת מדידות רשתית בערוץ אדום, לחזור לערוץ הירוק. עבור כל אינטרס אזורי של הרשתית, לחלק את הרקע מופחתים מדידה אדום על ידי מדידת-רקע ירוק מופחתים על מנת לנרמל את רמת האדום ניסיוני לרמת שליטה ירוק (איור 5).
6. קבע את סטיית תקן ממוצע של כל המדידות מנורמל עבור לבנות DsRed נתון (למשל, 5 מדידות לכל 3 פעמים הרשתית הרשתית נפרדת). על מנת להשוות כמותית את התוצאות של electroporations ביצע בימים שונים, תמיד כוללים משקעים "רגיל" / GFP DsRed בכל סט electroporation. ערכים ביטוי יחסי על פני ניסויים ניתן להשוות ידי נרמול רמת הביטוי של זה "סטנדרטי".

10. נציג תוצאות:

Electroporation תוצאות טובות ביטוי לבנות DNA (ים) על פני 1 / 4 עד 1 / 3 משטח הרשתית (איור 4 א). מאז photoreceptors מוט בפרט ביעילות transduced, טכניקה זו היא אידיאלית עבור לכימות photoreceptor ספציפי פעילות היזם (איור 4 ב). אנחנו בעבר השתמשו בגישה זו כדי לכמת מגוון של וריאנטים האמרגן של מוט ספציפי רו Gnat1 לוקוסים ^10. מצאנו כי ניתן לכמת את פעילות הפרומוטר על פני טווח של פי 300 כמעט.

איור 5 הוא במערך מדגם הרשתית electroporated יחיד. בדוגמה זו בפרט, ניסיוני לבנות pNrl (1.1kb)-DsRed נמדדה בערוץ אדום הבקרה לבנות pNrl (3.2kb)-GFP נמדדה בערוץ הירוק. מערך נתונים שלם עבור pNrl (1.1kb)-DsRed לבנות יכלול 6-9 הרשתיות נמדד באופן זה, וסטיית התקן יהיה מחושב על בסיס כל "DsRed מנורמל ל-GFP" ערכים. אם היינו משווים את רמת הביטוי של pNrl (1.1kb)-DsRed, למשל, pNrl (0.8kb)-DsRed, ואז בונה גם היה צריך להיות electroporated עם שליטה GFP אותו (למשל, pNrl (3.2kb) - GFP) ו צילמו במועדים חשיפה זהה. אפשר נתונים שנאספו בריכת בימים שונים אם תקן DsRed / electroporation GFP מבוצעת בכל יום (למשל, pNrl (3.2kb)-dsRed + pNrl (3.2kb)-GFP). בשביל לבנות את כל ניסיוני, רמת DsRed מנורמל יהיה לאחר מכן להיות מנורמל לרמה DsRed מנורמל של "תקן" (pNrl (3.2kb)-dsRed).

הטכניקה שאנו מתארים כאן הוא שימושי בעיקר עבור לכימות פעילות של צרס photoreceptor ^10,13.תא מסוג פעילות ספציפית cis-הרגולציה ניתן לכמת ב נדיר סוגי תאים ברשתית כגון תאים דו קוטבית ^14, אבל זה בדרך כלל דורש כי תחומי עניין לכימות להיבחר בחתכים אנכי ולא בהכנות flatmount. אותו הדבר נכון של צרס אשר כונן ביטוי סוגי תאים רבים כגון photoreceptors ותאים דו קוטבית. הפרוצדורות דומות אחרת.

באיור 1. סקירה של ההליך explant רשתית electroporation. ראשית, כל העיניים מבודדים הלידה 0 גורים יום העכבר ואת הרשתית הם גזור (P1). שנית, הרשתיות ממוקמים החדרים מלאים דנ"א electroporated (P2). שלישית, הרשתיות ממוקמים על מסננים בתרבית במשך שמונה ימים (P3). רביעית, explants הרשתית הם קבועים, רכוב על שקופיות הדמיה. עוצמת הקרינה נמדדת עם ImageJ תוכנה (P4). חמישית, הנתונים ImageJ מעובדים תוכנית גיליון אלקטרוני לכמת את ההבדל בפעילות של יזמים שונים (P5).

איור 2. בניית המנה electroporation. א) microslide קאמרית ללא שינוי מהרווארד Apparatus, BTX דגם 453 (קטלוג # 45-0105). ב) כלי Dremel משמש לחתוך את הידית מתלה צינור פלסטיק. הידית הוא חתך לתוך מפרידי מלבני עם הממדים הבאים: אורך 0.8cm, 0.6cm גובה, רוחב 0.3cm. ג) מפרידי הפלסטיק מותקנים לתוך תא microslide במרווחים שווים. איטום אקווריום מוזרק לתוך הפערים בין מפרידי (לא מוצג). ד) פס מתכת ממוקם מעל מפרידי. E) הבר מפרידי הם הידק לשקופית עם קליפים קלסר להחזיק הכל במקום כמו מתייבש איטום לילה. F) מפרידי יוסרו הבארות נבדקים כדי להבטיח שהם למים. G) השקופית סיים נכנס לתוך צלחת פלסטיק עם מוטות מתכת סמוך לחלון בצד של המנה.

איור 3. דיאגרמה של המנה electroporation עם הרשתית. החדרים מלאים פתרונות ה-DNA (עד חמישה פתרונות שונים בכל פעם). הרשתיות ממוקמים בתאי בכיוון כך העדשה נשען על מוט המתכת המחובר האלקטרודה החיובית, שלושה או ארבעה הרשתיות יתאים כל אחד מחמשת החדרים. זרם חשמלי יגרום מולקולות דנ"א שלילי טעון להעביר לתאי הרשתית.

איור 4.) ImageJ מדידת רמות הקרינה רשתית ב flatmount. תמונות בגווני אפור flatmount ב DsRed (ניסיוניים) ו-GFP (שליטה) הערוצים נפתחים בתוכנה ImageJ; לציין כי תמונות אלה היו בצבע לצורכי המחשה בלבד. חמישה מעגלים מדידה (1 עד 5) ממוקמות מעל אזורים electroporated אחיד, הימנעות בקצוות העדשה (קווים מקווקווים). שלושה עיגולים מדידה (6 עד 8) ממוקמות מחוץ הרשתית על מנת לקבוע את רמות הקרינה רקע. ב) חתך תמונות של explant רשתית electroporated בהספק גבוה. Explant היה קבוע יום לאחר הלידה 8, cryoprotected ב 30% sucrose/1X PBS לילה ב 4 ° C, מוטבע אוקטובר, ו cryo-מחולק ב 12μm. בונה פלורסנט pNrl (1.1kb) ו-DsRed pNrl (3.2kb)-GFP באים לידי ביטוי בתאים photoreceptor בשכבה החיצונית גרעיני (ONL). שכבת INL, הגרעין הפנימי; GCL, תא שכבת גנגליון.

איור 5. עיבוד נתונים הקרינה באמצעות Excel. בשלב 1, הערך הממוצע של פיקסל כל מעגל מדידה מועתק לתוך הגיליון האלקטרוני (תאים B3, B12, F3, F5, H3-H5). מדידות # 1-5 הם הערכים רשתית DsRed ו # 6-8 הם הערכים רקע DsRed; מדידות # 9-13 הם ערכי ה-GFP הרשתית # 14-16 הם הערכים רקע GFP. שים לב מדידה # 1 # 9 מתאימות מעגל המדידה זהה, וכך גם המידות # 2 ו - # 10, וכן הלאה. בשלב 2, ערך את הרקע הממוצע עבור ערוצי DsRed ו-GFP מחושב (תאים F6, H6). בשלב 3, על רקע ממוצע מופחת מדידה כל רשתית (בתאים C3-C12). בשלב 4, כל הרקע מופחתים מדידה DsRed הוא מנורמל למדידת GFP המתאימה (בתאים D3-D7).

Discussion

Electroporation Explant הוא אמצעי פשוט של לכימות cis-הרגולציה פעילות ברשתית עכבר מתפתחות. בהשוואה לניתוח cis-הרגולציה transgenesis באמצעות העכבר, electroporation הוא הרבה יותר זול, המחייב גורים עכבר היילוד בלבד, DNA, כלי לנתח, electroporation ו / תרבות ציוד רקמות. הוא גם הרבה פחות זמן רב: הניסוי אחד דורש רק כמה שעות של זמן הכנה, תקופה תרבות של כשמונה ימים, ולאחר כמה שעות בסוף הניסוי הדמיה וניתוח נתונים. Electroporation Explant היא גם מעולה לניתוח תרבות מבוססי cis-הרגולציה התא מאז רקמת הרשתית בפועל הוא מנוצל. הרשתית מתפתחת בדרך כלל די explant תרבות היא יוצרת שלוש שכבות נפרדות הסלולר (שכבת הגרעין החיצונית, שכבת הגרעין הפנימי, התא שכבת הגנגליון), למרות photoreceptors להיכשל לפרט מגזרים החיצונית.

יתרון נוסף הוא כי electroporation explant ניתנת לשחזור מאוד. בונה אותו electroporated לתוך הרשתית שונים, אפילו בימים שונים, בדרך כלל התוצאות באותן הרמות ביטוי יחסית. יתר על כן, מאז פלסמידים electroporated נחשבים שמרו episomally בגרעין ולא ישולבו כרומוזומים, הם אינם מופיעים להיות כפוף לאתר אותן השפעות האינטגרציה כי לבלבל cis-הרגולציה ניתוח שבוצע העכברים הטרנסגניים.

Electroporation Explant יש מספר מגבלות. ראשית, התאים רק כי הם עדיין מחזור התא יכול להיות יעיל transduced ידי electroporation ^15. ב P0, מוטות ושאר מאוחר יותר, יליד סוגי תאים ברשתית (תאים דו קוטבית, תאים amacrine, גליה M ller) הם אוכלוסיות תאים העיקרי ממוקד בשיטה זו. Electroporation של photoreceptors חרוט על ידי electroporation P0 דווחה ¹⁶ אך היעילות נראה נמוך. המגבלה השנייה היא תרבות explant מעבר שתי תוצאות שבועות מום הדרגתי של הרשתית ולכן אינו מומלץ. אם כימות היזם נדרש על timepoints מאוחר, לעומת זאת, ב electroporation vivo מאי ⁹ להתבצע, ואחריו לנתיחה רשתית ב timepoint הרצוי שטוח הרכבה של הרשתית גזור, וכימות, כמתואר בסעיף 9. המגבלה השלישית היא assay זה הוא רק בינוני תפוקה גבוהה. בניגוד לתרבות המבוססת על מבחני התא יכול לבדוק את מאות המבנים בניסוי אחד, את הטכניקה המתוארת פרוטוקול זה דורש מינימום של הרשתית עכבר אחד שלם לכל לבנות. לפיכך, רק תריסר בונה כמה סביר electroporated ביום.

אזהרה אחת נוספת לגבי כימות של הפעילות באמצעות מקדם את הגישה הנוכחית היא כי קיים פוטנציאל "לדמם דרך" של הקרינה DsRed לתוך התעלה GFP, במיוחד כאשר assaying היזמים חזקה מאוד. הסיבה לכך היא כי ספקטרום פליטה של ​​DsRed חופף חלקית את זה של ה-GFP. כדי לעקוף בעיה זו, מסנני פליטה מותאם אמור לשמש כי למזער את החפיפה בין ספקטרלי DsRed ו-GFP. כאשר כגון מערכות סינון אופטימיזציה אינם זמינים, עוד פתרון אפשרי יהיה להשתמש חלבון כחול מוזז ניאון (למשל, BFP או CFP) במקום ה-GFP.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	הערות (אופציונלי)
צלחת electroporation, Microslide 453	BTX הרווארד Apparatus	45-0105	ראה סעיף 1 בפרוטוקול לשינויים
100% גומי סיליקון מלט אקווריום	פרפקטו ייצור
Microtube פלסטיק מתלה	פישר סיינטיפיק	05-541	רק להתמודד עם מתלה ישמש
כלי Dremel			לחיתוך את הידית מתלה צינור פלסטיק
DMEM	Gibco / Invitrogen	11965
F12	Gibco / Invitrogen	11765
L-Glu/pen/strep	Gibco / Invitrogen	10378-016	100x ריכוז
אינסולין	סיגמא אולדריץ	I-6634	עבור המניות 1000x, resuspend ב 5mg/ml ב HCl 5mm ולסנן-לעקר
FBS	Gibco / Invitrogen	26140-079
ECM 830 כיכר גל electroporator	BTX הרווארד Apparatus
Nuclepore מסננים	Whatman	110606	25mm, 0.2μm
רקמות תרבות חממה			37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2
זכוכית coverslips # 1.5	פישר סיינטיפיק	12-544E	עבה 0.16mm
תרכובת מיקרוסקופ פלורסנט מצויד במצלמה			המצלמה צריכה להיות חד גוני (למשל, ORCA-ER מצלמה ידי Hamamatsu)
EGFP / להגדיר מסנן DsRed עבור מיקרוסקופ מתחם	Chroma טכנולוגיה קורפ	86007	זה bleedthrough להגדיר מסנן ממזער chanenels בין אדום וירוק
ImageJ תוכנה	NIH		http://rsbweb.nih.gov/ij/