Intravital التصوير من العقدة اللمفية الفأر المأبضية

Summary

وقد مكنت التطورات الحديثة في 2-الفوتون المجهري في الوقت الحقيقي في تصوير الوضع الطبيعي للأنسجة الحية في النماذج الحيوانية، وبالتالي تعزيز قدرتنا على التحقيق في سلوك الخلوية في كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية. هنا، نحن الخطوط العريضة الاستعدادات اللازمة لأداء التصوير intravital من العقدة اللمفية المأبضية الماوس.

Abstract

الغدد الليمفاوية (LNS) هي الأجهزة اللمفاوية الثانوية، والتي تحتل موقعا استراتيجيا في جميع أنحاء الجسم للسماح لمحاصرة وعرض المستضدات الأجنبية من الأنسجة الطرفية لرئيس الوزراء واستجابة جهاز المناعة على التكيف. جنبا إلى جنب بين الاستجابات المناعية الفطرية وقابلة للتكيف، وLN هو موقع مثالي لدراسة التفاعلات المناعية ^1،2 الخلية. الخلايا الليمفاوية (خلايا T والخلايا B والخلايا القاتلة الطبيعية)، والخلايا الجذعية (DCS)، والضامة تشكل الجزء الأكبر من نخاع العظام المستمدة من العناصر الخلوية من LN. ويحتل موقعا استراتيجيا هذه الخلايا في LN للسماح للمراقبة الفعالة للمستضدات الذات ومستضدات الأجانب المحتملين ^3-5. وهذه العملية التي واجهت بنجاح مستضدات الخلايا الليمفاوية وما شابه ذلك هو موضوع تحقيق مكثف في السنوات الأخيرة، وينطوي على تكامل الاتصالات الجزيئي بما في ذلك مستقبلات المستضد، جزيئات الالتصاق، كيموكينات، وهياكل اللحمية مثل شبكة الليفي شبكي ^2،6-12 . قبل وضع من فلوري في الوقت الحقيقي وعالية الدقة في التصوير الحي، والمحققين اعتمدوا على التصوير الثابت، الذي لا يقدم سوى الأجوبة المتعلقة التشكل، موقف، والهندسة المعمارية. في حين أن هذه الأسئلة أساسية في فهمنا لسلوك الخلايا المناعية، والقيود الذاتية مع هذه التقنية لا تسمح تحليل للاتجار اللمفاويات فك خيوط والبيئية التي تؤثر على سلوك الخلية الحيوية. في الآونة الأخيرة، وتطوير intravital اثنين من الفوتون سمح ليزر المسح المجهري (2P-LSM) المحققين لعرض حركات ديناميكية وتفاعلات الخلايا الفردية ضمن LNS حية في الموقع ^12-16. على وجه الخصوص، وقد طبقت نحن وغيرنا هذا الأسلوب لسلوك صورة الخلوية والتفاعلات داخل LN المأبضية، حيث شكله المدمج، والطبيعة كثيفة توفر ميزة الحصول على بيانات متعددة على مساحة والنسيج واسعة مع الهياكل الفرعية الأنسجة المختلفة ^11،17-18 . هذا أنامن المهم أن نلاحظ أن هذه التقنية توفر فوائد إضافية على explanted تقنيات التصوير الأنسجة، والتي تتطلب انقطاع الدم، وتدفق الليمفاوية، وفي نهاية المطاف ديناميات الخلوية للنظام. بالإضافة إلى ذلك، الأنسجة explanted لها نافذة محدودة للغاية من الوقت الذي لا تزال قابلة للحياة الأنسجة للتصوير بعد ازدراع. مع الترطيب المناسب ورصد أحوال الحيوان البيئية، يمكن تمديد الوقت التصوير بشكل ملحوظ مع هذه التقنية intravital. هنا، نقدم طريقة مفصلة لإعداد الماوس المأبضية LN لغرض أداء التصوير intravital.

Protocol

1. فأر حامل الجمعية

1. تراكب غطاء صحن 100 ملم بيتري الزجاج على رأس 100 مم من البلاستيك غطاء طبق بيتري أسفل. يجب أن يكون زجاج لمس بالكاد نقطة وسط طبق من البلاستيك. استخدام الزجاج واستنسل، تتبع علامة على طبق من البلاستيك.
2. استخدام الحفر اليد (أي DREMEL) لإزالة جزء من غطاء 100 مم طبق من البلاستيك لخلق منصة على شكل هلال. وهذا غطاء من البلاستيك على شكل هلال بمثابة دعم الجذع العلوي من الفأرة (الشكل 1A). حفر اثنين من الثقوب على غطاء على شكل هلال لتأمين قناع غاز مع معدن التعادل تطور. تأمين غطاء من البلاستيك على حافة طبق بيتري الزجاج باستخدام الغراء عظمى أو لاصق قوي مكافئ (الشكل 1B).
3. الغراء الأغطية اثنين من القبة الحد الأقصى للأنابيب PCR (قطع في المفصل) 1 سم بعيدا إلى وسط الطبق أسفل لغرض رسو اللوحات الجلد المأبضية.

2. فأر التحضير

ملاحظة: مع ممارسة ما يكفي، ينبغي للمرء أن يكون قادرا على أداء وإعداد الماوس والخطوات الجراحية في 20-30 دقيقة.

1. تخدير الماوس مع isoflurane (2 إلى 2.5٪ لتحريض، 1.5 إلى 2٪ للجراحة / التصوير) ممزوجين في 01:01 O _2: خليط الهواء بمعدل تدفق 1L/min باستخدام إجراء IACUC التي وافق عليها. وبمجرد أن الفأر هو تخدير، وتأمين قناع غاز على الأنف مع الشريط. تحديد ما إذا كان الفأر هو تخدير كامل بسبب عدم وجود استجابة إلى أخمص القدمين و / أو القرصات الذيل. ويمكن تعديل مستوى isoflurane وفقا لذلك لضمان مخدرا تماما الحيوان، وذلك، غير ثابت، جاهد معدل التنفس بين 60-80 الأنفاس / دقيقة.
2. استخدام الانتهازي الكهربائية لإزالة الشعر في الساق الخلفية اليمنى والمنطقة الاربية من الفأرة.
3. فرشاة الشعر بعيدا فضفاضة وتطبق بلطف معطفا متواضع من محلول نير على منطقة حليق مع مسحة القطن. بعد دقيقة واحدة من التطبيق الأولي، وإزالة نير وتنظيف البشرة المكشوفة مع مبللةمنشفة ورقية. تأكد من أن الفأر هو نظيفة وجافة قبل المتابعة.
4. جعل شق صغير مم 2-3 مع مقص في الركبة اليمنى لفضح وتر الباسطة.
5. تطبق Vetbond على طول وسط حامل الماوس حيث سيتم وضع الجسم الماوس وساق. تأمين بعناية الماوس على حامل، مع الركبة اليمنى لأسفل، للكشف عن الحفرة المأبضية حق. تأمين وتر الركبة اليمنى مع Vetbond في ما بين أصحاب البشرة رفرف 2 للمساعدة في استقرار مجال التصوير.
6. وتمتد والشريط الذراعين والساق اليسرى للمنصة العليا للحامل.
7. استخدام التعادل لضمان تطور قناع غاز في المكان.
8. وضع حامل تحت المجهر تشريح. يجب أن LN لا تزال على الاطلاق، بغض النظر عن حركة التنفس من الفأرة. ولذلك، يجب اتخاذ الاحتياطات أثناء تنفيذ عملية جراحية لتحسين الاستقرار في الساق. تحديد موقف من الذيل (عادة فوق الرأس) التي من شأنها أن تسهم في أعظمالاستقرار في الساق اليمنى والشريط أسفل الذيل.

3. عملية جراحية

1. في حين ضمن نطاق تشريح، والحفاظ على درجة حرارة الجسم فأر باستخدام سخان الفضاء أو وسادة التدفئة. للتصوير الناجح للLN المأبضية، فمن الأهمية بمكان للحفاظ على درجة حرارة الجسم السليم في جميع أنحاء عملية جراحية، وكذلك للحفاظ على رطوبة الأنسجة من خلال تطبيق برنامج تلفزيوني باستمرار الحارة للنسيج عرضة للخطر.
2. تعقيم الجلد مع Betadine. باستخدام مقص العقيمة، وجعل شق خط الوسط من خلال الجلد في حق منتصف الساق، ومواصلة تقطيع عموديا إلى الجزء العلوي من الفخذ الأيمن.
3. جعل اثنين من الشقوق الجلدية الأفقي أعلى من خط شق عمودي لإنشاء اللوحات الجلد على جانبي.
4. تراجع والغراء أسفل كل اللوحات الجلد مع Vetbond. وسوف تشد الجلد مشدود قبل تطبيق Vetbond تعزيز الاستقرار في الساق، ولكن تأكد من أن التوتر الجلد لا تسد تدفق الدم (أي التغيرات في vesseلون لتر أو القطر). تواصل الغراء أسفل مناطق أخرى من الجلد لضمان الاستقرار في الساق قبل تعريض LN. وسوف حجم الفأر تحديد مدى الحاجة إلى الجلد الزائد الغراء أسفل. عادة، فإن أكبر الفئران يتطلب أن تكون لاصق المزيد من الجلد لحاملها.
5. يجب أن LN تقع ضمن المبأبضية إما إلى اليمين أو اليسار من الوريد المأبضي، اعتمادا على موضع الماوس على حامل. بعناية فصل LN من الأنسجة الدهنية والعضلات المحيطة باستخدام الجزئي تشريح الملقط والملقط. للتقليل من النزيف والصدمات النفسية، واستخدام التقنيات التفلطح مع الدقيقة تشريح الملقط إلى أنسجة منفصلة. فضح بعناية LN المأبضية دون تعريض سلامة الأوعية الدموية وارد وصادر والأوعية اللمفاوية وارد.
6. بالنسبة للاستقرار النسيج واضاف، قد يتم وضع كوب غطاء مربع خلال LN رطبة، مجرد لمس بالكاد LN مع تجنب انسداد الأوعية. قد تكون غطاء زجاجي معالج الأمانإد مع نماذج من الطين على جانبي الماوس.
7. ويمكن إدخال الأصباغ الفلورية سفينة من مختلف الأحجام (على سبيل المثال، TRITC دكستران، والحد الأدنى من 70kDa) عن طريق الوريد في هذه المرحلة للمساعدة في تسليط الضوء على العلاقة الهيكلية وسلامة LN أثناء التصوير.

4. 2-الفوتون التصوير اكتساب **

1. مرة واحدة تتعرض على نحو كاف LN ويتم تحقيق الاستقرار، ونقل على وجه السرعة لصاحب الماوس كامل الجمعية على خشبة المسرح المجهر مزودة ردود الفعل درجة الحرارة للبرمجة وسادة التدفئة للرقابة في دائرة المجهر البيئية أبقى عند 37 درجة مئوية. إضافة عقيم يكفي دافئ (37 درجة مئوية) في برنامج تلفزيوني أو HBSS لغمر LN. فإن حجم تغيير اعتمادا على حجم والتنسيب من الفأرة. بدلا من ذلك، قد يتم تطبيق برنامج تلفزيوني دافئ أو HBSS مباشرة إلى LN تشريح من خلال ماصة الزجاج غرامة لتركيب المضخات التمعجية ومسجلة على عمود من الغمر هدف عدسة. وينبغي أن تدفق السائل يكون مثل أنيمكن الحفاظ على استقرار عمود الماء بين العدسة والنسيج.
2. الحفاظ على برنامج تلفزيوني أو درجة الحرارة HBSS عند 37 درجة مئوية باستخدام وسادة التدفئة مع لجنة التحقيق التعليق. يجب وضع مسبار درجة الحرارة في فصل صاحب الماوس للتأكد من درجة الحرارة في برنامج تلفزيوني في نطاق 36.5 إلى 37.5 درجة مئوية. ويمكن أيضا تحقيق المستقيم يمكن استخدامها لمراقبة درجة حرارة الجسم الأساسية من الفأرة التجريبية طوال الدورة التصوير.
3. استخدام برنامج التحصين الموسع، مصباح فلورسنت للمساعدة في وضع دليل LN تحت هذا الهدف. الحصول على مداخن صورة فلوري باستخدام الفواصل الزمنية التي هي مناسبة للتفاعل الخلوي المطلوب (عادة 10 ثانية إلى 1 دقيقة بين كل كومة صورة س ع ص).
4. رصد حالة الحيوان في غرفة المجهر في كثير من الأحيان عن طريق التفتيش البصري أو باستخدام نظام رصد الحيوانات. تحديد ما إذا كان الفأر هو تخدير كامل بسبب عدم وجود استجابة إلى أخمص القدمين و / أو القرصات الأظافر، وثابت، وغير معمول معدل التنفس بين 60-80 بreaths / دقيقة. ويمكن تعديل مستوى isoflurane وفقا لذلك لضمان أن يتم تحت التخدير الكامل للحيوان. مع الرصد السليم والماء، ويمكن تصوير الحيوانات لمدة 4-6 ساعات، أو ربما أطول.
5. بعد التجربة والتصوير، والموت ببطء الحيوان في غرفة CO ₂ باستخدام IACUC التي وافق عليها بروتوكول القتل الرحيم. لا ينبغي أن يسمح للحيوان من أجل الخروج من التخدير قبل القتل الرحيم.

* قد يكون هذا الإجراء الجراحي يكون من المفيد أيضا لأشكال أخرى من التصوير intravital بخلاف LSM-2P.

5. ممثل النتائج

يتم تجنيد مختلف خلايا المناعة المنتشرة في LN بمعدلات مختلفة بعد نقل بالتبني. لCD4 ⁺ و CD8 ⁺ الخلايا اللمفية، وهذه الخلايا تبدأ في الوصول إلى LN من خلال ارتفاع البطانية دقيقة (اتش اى فى) الوريد بعد نقل الرابع مع ​​أعداد كبيرة وصوله الى LN المأبضية بعد 2 إلى 4 ساعات ^6،17-18. لباء سلليرة سورية، وعدد كبير تتراكم بعد 8 إلى 24 ساعة ^19. وينبغي أن البلدان النامية المنشط تبدأ في الظهور في استنزاف المأبضية ساعات 8-16 LN بعد حقن ^3،11،16-17 قاطع الطريق. 2A الرقم يدل على ان حتى من دون معالم أخرى، يمكن تمييز هياكل مثل بصيلات الخلية B بسهولة عن طريق تراكم خلية كروية جولة مرئية تحت 2P-LSM ^19. باستخدام مراسل الذاتية فلوري مثل splenocytes ubiquitin-GFP (الشكل 2، فيديو إضافي 1 و 2)، يمكن للمرء أن تتبع هذه الهجرات اللمفاويات والسلوكيات لعدة أيام تصل إلى أسبوع في ظل الظروف الفسيولوجية غير المحفزة. مع متعدد القنوات للكشف عن حساسية عالية، فمن الممكن الحصول على بيانات التصوير المتعدد الذي يشمل المعلومات الهيكلية، فضلا عن دينامية التفاعل بين الشركاء الخلوية متعددة ^17،19.

عندما يتم تنفيذها بشكل صحيح التقنيات الجراحية والظروف البيئية رصدها بعناية، lymphocyوينبغي أن قسم التدريب والامتحانات يحمل سمة السرعة والهجرة، وكما هو موضح في الشكل 2C، 2D و ^13-14،16 في مكان آخر. الخلايا اللمفية قد يحمل أيضا اختلافات في سرعة الهجرة تبعا لمناطق فرعية من التصوير LN تمر، وسوف معالم إضافية حتى مثل الأوعية الدموية (كما يتضح من مقدمة السفينة من الأصباغ) تساعد على تحديد نوعية التصوير الكلي (أي التحكم في درجة الحرارة المناسبة ، الحد الأدنى من الصدمة إلى LN، الخ.) ^3،6،20.

الشكل 1. بناء حائز الماوس لLN الماوس التصوير المأبضية أ) الخطط التجمع حامل الماوس؛. ب) إعداد الممثل الماوس intravital ج) حامل الماوس أنجزت الجمعية د) عن قرب وجهات نظر LN المأبضية بعد التعرض الجراحية.

الشكل 2. تحليل الهجرة من الخلايا اللمفية + GFPفي LN المأبضية. (أ) لقطة 3D مأخوذة من تسلسل التصوير 2P-LSM من LN المأبضية في فأر متلق C57BL / 6 نقل adoptively مع 1x10 ⁷ أيام ⁺ GFP 1 اللمفاويات قبل التصوير. خط اندفاعة يدل على الحدود من بصيلات الخلية B، (ب) مسارات هجرة الخلايا اللمفاوية خلال 1 ساعة من التصوير المستمر؛ ج) توزيع إجمالي سرعة هجرة الخلايا اللمفاوية. يعني السرعة = 10.04 ± 4.26 ميكرون / للدقيقة (من مجموع 15125 المسارات تحليلها)؛ د) التفاضل سرعة الهجرة الخلوية توزيع الخلايا الموجودة في جراب الخلية B (الحانات مفتوحة، يعني السرعة = 8.79 ± 3.90 ميكرون / دقيقة، 1525 مجموع تحليل المسارات ) ومنطقة تي خلية (الحانات مغلقة؛ يعني السرعة = 13.77 ± 5.93 ميكرون / دقيقة، ما مجموعه 1250 تحليل المسارات). شريط النطاق = 50 ميكرون.

تكميلية الفيديو 1. الوقت الفاصل بين intravital 2P-LSM التصوير على فأرة الحاسوب المأبضية LN كما هو موضح في الشكل رقم 2. تم عزل ما مجموعه من الخلايا الليمفاوية ⁷ 1x10 الابأم متبرع + ubiquitin-GFP الماوس ونقل adoptively عن طريق الوريد إلى الفأر المتلقي C57BL / 6 قبل 24 ساعة من التصوير. وكانت سلسلة من س ص (750 ميكرون × 750 ميكرون) واتخذت صور مضان من خلال مداخن Z ثابت (خطوات ميكرون 5 و 13 خطوات) أن يؤديا إلى كومة التصوير XYZ (750 ميكرون × 750 × 65 ميكرون ميكرون)، والذي كان يتكرر كل 20 ثانية أي ما مجموعه 60 دقيقة، مما أدى إلى تسلسل التصوير xyzt للتحليل السرعة (أرقام 2C، 2D). قراءة السرعة = 450X. شريط النطاق = 50 ميكرون. قضاء الوقت = دقيقة: ثانية. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو تكميلية .

تكميلية فيديو 2 تم تكبيره في ضوء تسلسل التصوير في فيديو إضافي 1 في جراب الخلية ب - تي منطقة الحدود الخلية. قراءة السرعة = 450X. شريط النطاق = 25 ميكرون. الطابع الزمني = دقيقة: ثانية Cلعق هنا لمشاهدة الفيديو التكميلي.

Discussion

وقد صاحبت التطورات الحديثة في ذات الدقة العالية في تقنيات التصوير في الموقع، خصوصا 2P-LSM، من خلال الاهتمام المتزايد في دراسة سلوك الخلوية الحيوية في الجسم الحي. تقنية التصوير 4D على LN المأبضية على فأرة الحاسوب حية تسمح مثل هذه التحليلات في السلوك الديناميكي من الخلايا المناعية داخل النسيج undisrupted الصغرى البيئة. استخدام LSM-2P مع كاشفات متعددة تغطي كامل الطيف المرئي يسمح في وقت واحد لجمع البيانات والتصوير من السكان الخلية متعددة. ويمكن الآن يمكن تحقيق ذلك من خلال استخدام الخلايا في الجسم الحي محددة الفئران مراسل فلوري (على سبيل المثال، Ubiquitin eGFP، طلب تقديم العروض، أو eCFP-) جنبا إلى جنب مع الاستفادة من نقل بالتبني من سكان الخلية المسمى تفاضلي باستخدام الأصباغ العضوية خلية فلوري (على سبيل المثال CFSE ، SNARF-1، وخلية المقتفي أورانج) لبحث الآليات الخلوية وظيفة داخل LN. بالإضافة إلى الملاحظة المباشرة للتفاعلات بين ج تتبع تفاضليالسكان الذراع، لا يمكن للبيانات التصوير المتعدد الخضوع لمزيد من التحليل المتاحة تجاريا مع برامج التصوير برامج معالجة (على سبيل المثال Imaris، BitPlane شركة) لتوضيح مزيد من سلوك الخلايا وظيفة. مجموعة واسعة من الاحتمالات موجودة لدراسة آليات التفاعل الخلوية باستخدام هذه في الجسم الحي، وعلى تقنيات السيليكو.

القيد الرئيسي من المنهج التجريبي وصفها هنا هو التعقيد التقني الكامنة في نهج عملية جراحية. هذا الأسلوب يتطلب تدريب صارم لتصبح مألوفة مع تشريح ذات الصلة، والإجراءات الدقيقة والمهارات الفنية كما هو مطلوب بموجب هذا البروتوكول. العوامل يزيد من تعقيد وتشمل صعوبة في الحد من تلف الأنسجة أثناء التنقيب LN، وتحسين الاستقرار الأنسجة أثناء التصوير، ومنع الإصابة الحرارية والليزر إلى LN قبل وأثناء تجريب التصوير. واضطراب في أي من هذه العوامل تؤدي إلى أقل من المستوى الأمثل الليمفاويةوالحركة ocyte وبالتالي التدخل مع التفسير الصحيح لتحليل البيانات الناتجة التصوير.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane، جامعة جنوب المحيط الهادئ	شركة باكستر للرعاية الصحية	NDC 10019-773-60
Vetbond	3M	1469SB
نير - شعر محلول إزالة	نير
برنامج تلفزيوني، 1X	Cellgro	21-040-CV
تدفئة وسادة	Watlow
التدفئة لوحة تحكم	Watlow
الهواء وسين 2	Airgas
درجة الحرارة مسبار	هارفارد جهاز
الملقط دومون # 5	العالم أدوات دقيقة، وشركة	14101
الملقط، غريف ايريس، 7 سم منحني	العالم أدوات دقيقة، وشركة	14141
مقص	Roboz أداة جراحية المحدودة، وشركة	RS-5880
غطاء من 100x20 ملم صحن زجاج ثقافة الخلية	كورنينج	70165-102
غطاء من 100x20 ملم طبق البوليسترين ثقافة الخلية	كورنينج	430167
Betadine الحل (10٪ Povidine-اليود الحل موضعي)	بوردو المنتجات، LP	NDC 67618-150-08