마우스 오금 림프절의 Intravital 이미징

요약

2 - 광자 현미경의 최근 발전은 실시간으로 활성화했습니다에서 원위치 동물 모델에서 라이브 조직의 이미징,이를 physiologic 및 pathologic 두 조건에서 세포의 행동을 조사하는 능력을 향상. 여기서는 마우스 오금 림프절의 intravital 이미징을 수행하는 데 필요한 준비를 설명합니다.

초록

림프절 (LNs)는 전략적으로 적응 면역 반응을 수상하기 위해 말초 조직에서 외국 항원의 트래핑 및 프레 젠 테이션을 할 수 있도록 신체 전반에 걸쳐있는 이차 림프​​ 기관입니다. 타고난 및 적응 면역 반응 사이 Juxtaposed, 아까 면역 세포 상호 작용에 ^1,2을 공부할 수있는 이상적인 사이트입니다. Lymphocytes은 (T 세포, B 세포와 NK 세포), 돌기 세포 (DC가) 및 macrophages는 뼈 후면의 세포 요소에게 골수 - 유래의 일괄 구성됩니다. 이러한 전지는 전략적으로 자기 항원 및 잠재 외국 항원 ^3-5의 효율적인 감시를 허용하도록 후면에 위치하고 있습니다. lymphocytes가 성공적으로 기원 항원가 발생하는 과정은 최근 몇 년 사이에 강렬한 수사 대상이며, 항원 수용체, 유착 분자, chemokines, 그러한 fibro-망상 네트워크 ^2,6-12 등 stromal 구조를 포함한 분자 연락처의 통합을 포함 . 이전에만 형태, 위치, 그리고 건축에 관한 해답을 제공하고 생체내 이미징, 정적인 이미지에 의존 조사단에서 고해상도 실시간 형광등의 발전합니다. 이 질문은 면역 세포의 행동에 대한 우리의 이해에 근본적인 반면,이 기술을 고유 제한 해독 림프구 밀매 및 동적 셀 행동에 영향을 미치는 환경 단서에 분석을 허용하지 않습니다. 최근 intravital의 발전은 두 광자 레이저 스캐닝 현미경 (2P-LSM)는 수사관들이 현장 ^12-16에서 라이브 LNs 내에 역동적인 움직임 및 개별 세포의 상호 작용을 볼 수있었습니다. 특히, 우리와 다른 다양한 조직 하부 구조 ^{11,17-18와의} 소형 고밀도 자연 대규모 조직 영역을 통해 멀티 플렉스 데이터 수집의 장점을 제공 오금 에선, 내 이미지 세포 행동과 상호 작용이 기법을 적용 . 그것은 내가의 중요한이 기술 혈액 장애, 림프의 흐름, 그리고 시스템의 궁극적 세포 역학을 필요로 explanted 조직 이미징 기술, 이상의 추가적인 장점을 제공합니다하십시오. 또한 explanted 조직은 조직이 explant 후 이미징을위한 실용적 남아있는 시간은 매우 적어 있습니다. 동물의 환경 조건의 적절한 보습 및 모니터링을 통해 이미징 시간이 대폭이 intravital 기법으로 확장할 수 있습니다. 여기서는 intravital 이미징을 수행할 목적으로 마우스 오금의 종이를 준비에 대한 자세한 방법을 제시.

프로토콜

1. 마우스 홀더 어셈블리

1. 아래로 향하게 100 mm 플라스틱 배양 접시의 뚜껑 위에 100 mm 유리 페트리 접시의 뚜껑을 입혀라. 유리는 거의 플라스틱 접시의 중심점를 만지고해야합니다. 유리를 사용하면 스텐실로, 플라스틱 접시에 마크를 추적.
2. 초승달 모양의 플랫폼을 만드는 100 mm 플라스틱 접시 뚜껑의 일부를 제거하는 핸드 드릴 (예 : Dremel)를 사용합니다. 이 초승달 모양의 플라스틱 뚜껑은 마우스 (그림 1A)의 상반신에 대한 지원이 될 것입니다. 금속 트위스트 넥타이로 방독면을 확보하기 위해 초승달 모양의 뚜껑에 두개의 구멍을 드릴 다운합니다. 슈퍼 접착제 또는 equivalently 강한 접착제 (그림 1B)를 사용하여 유리 페트리 접시의 가장자리에 플라스틱 뚜껑을 고정합니다.
3. 접착제이 돔형 - 캡 PCR 튜브 (경첩에서 잘라내) 떨어져 오금 피부 펄럭를 고정의 목적을 위해 바닥 접시의 중앙에 1cm의 뚜껑.

2. 마우스 준비

참고 : 충분한 연습을 통해, 하나 20-30분에 마우스 준비와 수술 단계를 수행할 수 있어야합니다.

1. (유도 2 ~ 2.5 %, 수술 / 이미지를위한 1.5-2 %) 1시 1분 O ₂ isoflurane admixed와 마우스를 마취 : 1L/min의 유속에서 공기 혼합물은 IACUC 승인 절차를 사용합니다. 일단 마우스가 anesthetized이며, 테이프와 코 위에 방독면을 확보하라. 마우스 발가락 및 / 또는 꼬리 pinches에 대한 응답의 부족에 의해 완전히 anesthetized 있는지 확인합니다. isoflurane의 수준은 동물이 완전히 숨을 60-80 / 분 사이에 꾸준한 비 고심한 흔적 호흡 속도와 함께 안정을 취해되도록 적절하게 조정할 수 있습니다.
2. 뒷다리 다리와 마우스를 사타구니 지역에 머리카락을 제거하는 전동 트리머를 사용합니다.
3. 멀리 느슨한 머리를 빗질하고 부드럽게 면봉으로 면도 지역에 나이르 로션의 겸손한 코트를 적용합니다. 초기 애플 리케이션 1 분 후 나이르를 제거하고 습기가있는 노출된 피부를 깨끗하게종이 타월. 마우스가 깨끗하고 진행하기 전에 건조한지 확인하십시오.
4. 신근 힘줄 노출 오른쪽 무릎에 가위로 작은 2~3밀리미터의 절개를합니다.
5. 마우스 몸체와 다리가 위치됩니다 마우스 홀더의 중앙을 따라 Vetbond 적용합니다. 조심스럽게 오른쪽 오금 fossa을 폭로하기 위해, 아래 오른쪽 무릎으로 홀더에 마우스를 확보. 이미지 필드를 안정화하는 데 도움이 피부 플랩 보유자 사이에 Vetbond과 오른쪽 무릎 힘줄 고정합니다.
6. 스트레치 테이프 팔, 홀더의 위쪽 플랫폼에 왼쪽 다리.
7. 장소에서 방독면을 확보하기 위해 트위스트 넥타이를 사용합니다.
8. 해부 현미경 하에서 홀더를 놓습니다. 더구나, 물론 여전히 마우스 호흡 운동의 독립 남아 있어야합니다. 다리의 안정성을 최적화하기 위해 수술을 수행하는 동안 따라서 예방 조치들이 취해 있어야합니다. 최고에 기여할 꼬리 (일반적으로 머리 위)의 순위를 결정오른쪽 다리와 테이프 아래에서 꼬리까지 안정.

3. 외과

1. 절개 범위 아래에 있지만, 우주 히터 또는 가열 패드를 사용하여 마우스 체온을 유지하고 있습니다. 오금 에선 성공 이미징 들어, 지속적으로 노출된 조직에 따뜻한 PBS를 적용하여 조직의 수분을 유지하기 위해뿐만 아니라 수술에 걸쳐 적절한 체온을 유지하는 것이 중요합니다.
2. Betadine으로 피부를 소독. 멸균 가위를 사용 중반 송아지 오른쪽의 피부를 통해서 중간선 절개를하고, 오른쪽 허벅지의 우수한 부분을 수직으로 절단까지 계속됩니다.
3. 양쪽에 피부 펄럭를 만드는 수직 절개 라인의 상단에 두명의 수평 피부 incisions을 만듭니다.
4. Vetbond로 모두 피부 아래 펄럭 철회 및 접착제. Vetbond를 적용하기 전에 긴장된 피부를 당기는 것은 더욱 다리의 안정성을 홍보할 수 있지만, (vesse 즉 변화 피부의 긴장은 혈액 흐름을 막다하지 않도록난 색상이나 직경). 그 종이를 노출하기 전에 다리의 안정성을 보장하기 위해 피부의 다른 영역에 다운 접착제로 진행합니다. 마우스의 크기는 여분의 피부가 접착제로 필요한 양을 결정합니다. 일반적으로 더 큰 생쥐보다 피부가 홀더에 붙어 수 있어야합니다.
5. 아까 오른쪽 중 오금 fossa 안에 존재하거나 오금 정맥 왼쪽, 홀더에 마우스의 위치에 따라해야합니다. 마이크로 해부 족집게와 집게를 사용하여 주위의 지방 조직 및 근육에서 종이를 조심스럽게 분리. 출혈과 충격을 최소화하기 위해 별도의 조직으로 핀셋을 마이크로는 해부와 splaying 기법을 사용합니다. 조심스럽게 수입 성의와 efferent 혈관과 수입 성의 림프 혈관의 무결성을 위태롭게하지 않고 오금 에선 노출.
6. 추가된 조직의 안정성 들어, 사각형 커버 유리가 혈관 폐색을 피하면서 살짝만 종이를 만지고, 젖은 종이 위에 배치됩니다. 커버 유리는 secur 수 있습니다마우스의 양쪽에 점토 모델링과 에드.
7. 다양한 크기 (예 : TRITC-dextran, 70kDa 최소)의 형광 선박 염료는 이미징 동안 종이의 구조적 관계와 무결성을 강조하기 위해이 시점에서 정맥 도입 수 있습니다.

4. 2 - 광자 이미징 취득 **

1. 에선가 적절하게 노출되고 안정성이 달성되면 즉시 37으로 유지 환경 현미경 챔버에서 프로그래밍 온도 피드백 제어 가열 패드를 들으며 현미경 스테이지 ° C.에 전체 마우스 홀더 어셈블리를 전송 추가 충분한 멸균 따뜻한 (37 ℃) PBS 또는 HBSS 잠수함 에선를합니다. 볼륨은 마우스의 크기와 위치에 따라 변경됩니다. 또는 따뜻한 PBS 또는 HBSS는 연동 펌프에 장착 미세 유리 피펫을 통해 해부 에선 직접 적용 침지 렌즈 목적의 열 테이프로 붙여져 수 있습니다. 액체의 흐름은되어야한다고안정적인 물 열은 렌즈와 조직 사이에 유지 수 있습니다.
2. 37 PBS 또는 HBSS 온도를 유지 ° C 피드백 프로브와 함께 가열 패드를 사용합니다. 별도의 온도 프로브는 37.5 ° C.에 36.5의 범위에 PBS의 온도를 확인하는 마우스 홀더에 배치되어야합니다 직장 프로브는 또한 이미징 세션에 걸쳐 실험용 마우스의 핵심 체온을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.
3. 목표하에 안내 하냐구요 배치를 돕기 위해 에피 형광 램프를 사용하십시오. 원하는 세포 상호 작용 (각 XYZ 이미지 스택 사이에 일반적으로 10 초로 1 분)에 적합한 시간 간격을 사용하여 형광 이미지 스택을 습득.
4. 육안 검사에 의한이나 동물의 모니터링 시스템을 사용하여 자주 현미경 챔버의 동물의 상태를 모니터링합니다. 마우스 발가락 및 / 또는 네일 pinches에 대한 응답의 부족에 의해 완전히 anesthetized 있는지 확인하고, 60-80 B 사이에 꾸준한 비 고심한 흔적 호흡 속도reaths / 분. isoflurane의 수준은 동물이 완전히 회복될되도록 적절하게 조정할 수 있습니다. 적절한 모니터링 및 수화를 통해 동물 4~6시간 동안 몇 군데, 또는 아마 더 이상 할 수 있습니다.
5. 이미징 실험 후 IACUC 승인 안락사 프로토콜을 사용하여 CO ₂ 챔버에서 동물을 안락사시켜야. 동물 전에 안락사에 마취 반발을 허용하지 말아야합니다.

**이 수술 또한, 2P-LSM 이외 intravital 이미징 다른 형태 유용할 수 있습니다.

5. 대표 결과

각종 순환 면역 세포는 입양 전송에 따라 다른 속도로 종이를 모집하고 있습니다. CD4 ⁺ 및 CD8 내용 ⁺ lymphocytes,이 전지는 2~4시간 ^6,17-18 뒤 오금 종이에 도착 상당한 숫자 IV 전송 후 높은 내피 venule (HEV) 분도 종이에 도착하기 시작. B cel의 경우이거, 상당한 숫자 8~24시간 ¹⁹ 이후에 축적됩니다. 활성의 DC가이 노상 강도 주입 ^3,11,16-17 따라 배수 오금 에선 8-16시간에 나타나기 시작합니다. 그림 2A도 다른 랜드마크없이 같은 B 세포 모공과 같은 구조 2P-LSM ¹⁹ 세 이하 보이는 둥근 구면 세포 축적에 의해 쉽게 분별 수 있도록 보여줍니다. 같은 ubiquitin-GFP의 splenocytes (그림 2, 보충 비디오 1 및 2)와 같은 내생 형광 리포터를 사용하면, 하나가 아닌 stimulatory physiologic 조건에서 일주일에 며칠 동안 이러한 림프구 마이 그 레이션과 행동을 추적할 수 있습니다. 다중 채널 고감도 탐지기로, 그것은 여러 세포 파트너 ^17,19 간의 구조적인 정보는 물론 상호 작용 역학을 포함 멀티 플렉스 이미징 데이터 세트를 취득하는 것이 가능합니다.

수술 기법이 제대로 실행 및 환경 조건은 주의깊게 모니터링하고 lymphocy오셨는 다른 ^13-14,16 그림 2C, 2D와에서 보여준 특징적인 마이 그 레이션 속도를, 전시한다. Lymphocytes 또한 에선 겪고 이미징의 하위 영역에 따라 마이 그 레이션 속도에 차이가 발생할 수 있습니다, 이러한 혈관 (같은 선박 염료의 도입에 의해 강조)만큼 추가적인 랜드마크는 전체적인 이미지 품질 (즉, 적절한 온도 제어를 결정하는 데 도움이됩니다 , 종이 등에 최소한의 외상) ^3,6,20.

1 그림. 마우스 오금 에선 이미징을위한 마우스 홀더 건설) 마우스 홀더 어셈블리의 설계도,. b)는 대표 intravital 마우스 준비, C) 준공 마우스 홀더 조립, D) 수술 노출 후 오금 후면의 경관 업을 닫습니다.

그림 2. GFP + lymphocytes의 마이 그 레이션 분석오금 후면에. () 6 / C57BL받는 마우스에 오금 에선 2P-LSM 이미징 시퀀스에서 가져온 3D 스냅샷 adoptively 사전 이미징에 1x10 ⁷ GFP ⁺ lymphocytes 일일 함께 양도. 대시 선의 B 세포 머리카락 경계를 나타냅니다, (b)는 지속적인 이미징 1 시간에 림프구 이주 트랙, 전반적인 림프구 마이 그 레이션 속도 C)은 유통. 속도를 평균 = 10.04 ± 4.26 μm의 / 분 (분석 15,125 트랙의 총), D)의 B 세포 대과에서 발견된 세포의 차동 세포 마이 그 레이션 속도 분포 (오픈 바, 총 1525 트랙 분석; 속도 = 8.79가 ± 3.90 μm의 / 분 뜻 ) 및 T 세포 영역 (닫힌 바, 의미 속도 = 13.77 ± 5.93 μm의 / 분, 분석한 1250 트랙의 총). 스케일 막대 = 50 μm의.

보충 비디오 1. 같은 그림 2에 설명된 마우스 오금 제품 에선 시간 경과 intravital 2P-LSM 이미징. 1x10 ⁷ lymphocytes의 총 고립되었다 금톰 ubiquitin-GFP + 공여 마우스와 adoptively 24시간 이미징 전에 C57BL / 6 마​​우스로받는 자에게 양도. XY의 일련 (750 μm의 X 750 μm의) 형광 이미지는 매 20 초 동안 반복되었다 XYZ 이미징 스택 (750 μm의 X 750 μm의 X 65 μm의)를 양보하기 위해 고정 Z 스택 (5 μm의 단계, 13 단계)을 통해 찍은 속도 분석 (그림 2C, 2D)에 대한 xyzt 이미징 순서대로 발생 60분의 총입니다. 재생 속도 = 450x. 스케일 막대 = 50 μm의. 타임 스탬프 = 분 : 초. 보완 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오 .

보충 비디오 2 B 세포 대과에서 보충 비디오 1 이미징 시퀀스보기 확대 기능 -. T 세포 영역 테두리. 재생 속도 = 450x. 스케일 막대 = 25 μm의. 타임 스탬프 = 분 :. 초 C추가 비디오를 시청하려면 여기를 핥지.

토론

특히 현장 이미징 기법, 2P-LSM에서 고해상도의 최근 발전은 생체내의 역동적인 세포 행동의 연구에 관심이 점점 동반되었습니다. 살아있는 생쥐의 오금 종이에 4D 이미징 기술 undisrupted 조직 마이크로 환경 내에서 면역 세포의 역동적인 동작과 같은 해석이 가능합니다. 전체 가시 스펙트럼에 걸쳐 여러 메이커와 2P-LSM의 사용은 여러 세포 인구의 동시 이미징 데이터 수집을 허용합니다. 이것은 지금 (유기 형광 세포 염료를 사용하여 differentially 표시된 세포 인구의 입양 전송의 사용과 결합된 생체내 세포 고유의 형광 리포터 생쥐 (예 : Ubiquitin-eGFP,-RFP, 또는 eCFP)에의 사용을 통해 달성될 수 예 CFSE , SNARF-1, 그리고 그 종이 안에 세포 메커니즘과 기능을 검토하는 셀 트래커 오렌지). differentially 추적 간의 상호 작용의 직접적인 관찰 이외에엘자의 인구는 멀티 플렉스 이미징 데이터 세트가 더 셀 행동과 기능을 명료하게하다하는 상용 영상 처리 소프트웨어 프로그램 (예 : Imaris, BitPlane 주식 회사)와 자세한 분석을 받다 수 있습니다. 가능성의 광범위한 배열은 생체내 및 silico 기술의 이러한 사용하여 세포의 상호 작용 메커니즘을 연구하기 위해 존재합니다.

여기에서 설명한 실험적 접근 방법의 주요 한계는 수술 접근법에 내재된 기술적 복잡합니다. 이 기술은 관련 해부학 및 정확한 기술적 절차 및이 프로토콜이 요구하는대로 능력을 잘 알고있는가되는 엄격한 훈련이 필요합니다. 더 복잡한 요인 에선 탐사 기간 동안 조직의 손상을 최소화의 어려움, 이미징 동안 조직의 안정성을 최적화하고, 전 후면에 열 및 레이저 부상 방지 및 이미징 실험 중에 포함됩니다. 이러한 요소 중 하나에 섭동가 낮은 최적의 림프가 발생합니다ocyte 운동성 및 따라서 영상 데이터 분석 결과의 적절한 해석을 방해합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP	박스터 헬스케어 주식 회사	NDC 10019-773-60
Vetbond	3M	1469SB
나이르 - 제모 로션	나이르
PBS, 1X	Cellgro	21-040 - 이력서
생리대	Watlow
난방 패드 컨트롤러	Watlow
에어와 O 2	Airgas
온도 프로브	하버드 장치
족집게 뒤몽 # 5	세계 정밀 계측기, INC	14,101
세계 정밀 계측기, INC	14,141
가위	Roboz 외과 악기 (주) INC	RS-5880
코닝	70165-102
코닝	430,167
Betadine 솔루션 (10 % Povidine - 요오드 연고제 솔루션)	퍼듀 제품, LP	NDC 67618-150-08