Intravital Görüntüleme Fare Popliteal Lenf Nodu

Özet

2-foton mikroskopi son gelişmeler, gerçek zamanlı sağladı 'De Hayvan modellerinde canlı dokuların yerinde görüntüleme, böylece hem fizyolojik ve patolojik koşullar hücresel davranışı araştırmak için kabiliyetinin artırılması. Burada, fare popliteal lenf nodu intravital görüntüleme gerçekleştirmek için gerekli hazırlıkları özetlemektedir.

Özet

Lenf nodları (LN), stratejik adaptif immün yanıtı asal periferik dokularda yabancı antijenleri yakalama ve sunum için izin vermek için vücutta bulunan ikincil lenfoid organlara. Doğal ve adaptif immün yanıtları arasındaki yan yana, LN, bağışıklık hücre etkileşimleri ^1,2 çalışmak için ideal bir yerdir. Lenfositler (T hücreleri, B hücreleri ve NK hücreleri), dendritik hücreler (DC), makrofaj, kemik iliği kaynaklı LN hücresel elemanlar toplu oluşmaktadır. Bu hücreler stratejik, öz antijenleri ve potansiyel yabancı antijenlere ^3-5 verimli tarama izin LN konumlandırılmıştır. Lenfositler başarıyla soydaş antijen karşı karşıya tarafından son yıllarda yoğun bir araştırma süreci bir konudur ve antijen reseptörleri, adezyon molekülleri, kemokinler ve böyle fibro-retiküler ağ ^2,6-12 gibi stromal yapılar da dahil olmak üzere moleküler kişileri bir entegrasyon içerir . Önce sadece morfoloji, konumu ve mimarisi ile ilgili cevaplar sunuyor in vivo görüntüleme, statik görüntüleme dayanıyordu araştırmacılar, yüksek çözünürlükte gerçek zamanlı floresan gelişimi. Bu soruların immün hücre davranışı anlayışımızın temel olmakla birlikte, bu teknik ile içsel sınırlamaları deşifre lenfosit trafiği ve dinamik hücre davranışını etkileyen çevresel ipuçlarını analiz izin vermez. Son zamanlarda, intravital gelişimi iki-foton lazer tarama mikroskobu (2P-EKK) araştırmacılar, ^12-16 yerinde canlı LN içinde dinamik hareketler ve bireysel hücrelerin etkileşimlerini görüntülemek için izin verdi. Özellikle, biz ve diğerleri çeşitli doku alt yapıları ^11,17-18 ile kompakt, doğada büyük bir doku alana multipleks veri toplama avantajı sunuyor popliteal LN, içinde görüntü hücresel davranış ve etkileşimler bu tekniği uyguladık . Bu iönemlidir bu tekniğin kan bozulması, lenf akışı ve sistemin eninde sonunda hücresel dinamikleri gerektiren eksplante doku görüntüleme teknikleri üzerine ilave avantajlar sunuyor unutmayın. Ayrıca, eksplante dokuları doku, eksplant sonra görüntüleme için geçerli olmaya devam eden bir zaman çok sınırlı bir pencere var. Hayvan çevre koşullarına uygun hidrasyon ve izleme sayesinde, görüntüleme süresi önemli ölçüde bu intravital tekniği ile uzatılabilir. Burada, gerçekleştirme intravital görüntüleme amacıyla, fare popliteal LN hazırlamak için ayrıntılı bir yöntem sunulmaktadır.

Protokol

1. Fare Tutucu Meclisi

1. Kapak aşağı bakan bir 100-mm plastik Petri kapağı üstüne bir 100-mm cam Petri Overlay. Zorlukla cam, plastik çanak merkez noktası dokunmadan edilmelidir. Cam kullanarak bir şablon gibi, plastik tabak üzerine bir iz iz.
2. Bir hilal şeklinde bir platform oluşturmak için bir 100-mm plastik tabak kapağı bir kısmını kaldırmak için bir el matkabı (yani Dremel) kullanın. Bu hilal şekilli plastik kapak fare (Şekil 1a) üst gövde için bir destek olarak hizmet verecek. Hilal şeklinde kapak gaz maskesi bir metal büküm kravat ile güvence altına iki delik delin. Süper yapıştırıcı veya eşdeğer güçlü bir yapıştırıcı (Şekil 1b) kullanarak cam Petri kenarına plastik kapak sabitleyin.
3. Tutkal kubbeli iki kapaklı PCR tüpleri (menteşe kesilmiş) 1 cm arayla, popliteal deri flepleri demirlemenin amaç için alt çanağı merkezi kapaklar.

2. Fare Hazırlık

Not: Yeterli pratikle, bir 20-30 dakika içinde fare hazırlanması ve cerrahi basamakları gerçekleştirmek mümkün olmalıdır.

1. (% 2-2,5 indüksiyonu için, cerrahi / görüntüleme için% 1,5-2) 01:01 O ₂ izofluran karıştırılabilen fare uyuştur onaylı IACUC bir prosedür kullanılarak hava karışımı 1L/min bir akış hızında. Sonra fare anestezi, bir gaz maskesi bant ile burun üzerinde sabitleyin. Fare ayak ve / veya kuyruk tutam yanıt eksikliği ile tam bir anestezi olup olmadığını belirlemek. İzofluran hayvan tamamen 60-80 solunum / dk arasında sürekli olmayan, emek solunum hızı, sedasyon düzeyi sağlamak için uygun şekilde ayarlanabilir.
2. Farenin sağ arka bacak ve kasık bölgesine saç kaldırmak için bir elektrik düzeltici kullanın.
3. Uzak gevşek saç fırçalayın ve bir pamuklu çubukla hafifçe, traşlı alan üzerine, Nair losyon mütevazı bir kat uygulayın. Bir dakika sonra, ilk uygulama Nair çıkarın ve nemli bir maruz kalan deri temizkağıt havlu. Fare devam etmeden önce temiz ve kuru olduğundan emin olun.
4. Ekstansör tendon ortaya çıkarmak için, sağ diz makasla küçük bir 2 ila 3 mm insizyon olun.
5. Merkezinde, fare vücut ve bacak yerleştirilmiş edilecektir fare tutucunun boyunca Vetbond uygula Dikkatlice, aşağı doğru diz sağ popliteal fossa maruz tutucuya fare sabitleyin. Sağ diz tendonu, görüntüleme alanda istikrara kavuşturmak için, 2 flep sahipleri arasında Vetbond ile sabitleyin.
6. Stretch ve bant kol ve sol bacak üst platforma sahibinin.
7. Gaz maskesi yerine sabitlemek için bir büküm kravat kullanın.
8. Diseksiyon mikroskobu altında tutucu yerleştirin. LN, kesinlikle hala fare nefes alıp verme hareketi bağımsız kalmalıdır. Bu nedenle, ameliyat yaparken bacak istikrar optimize etmek için önlemler alınmalı. Büyük katkıda bulunacaktır, kuyruk (tipik olarak kafa yukarıda) pozisyonunu belirlemekSağ bacak ve bant aşağı kuyruk istikrar.

3. Cerrahi

1. , Diseksiyon kapsamında iken, bir ısıtıcı veya bir ısıtma pedi kullanarak fare vücut ısısını korumak. Başarılı popliteal LN görüntüleme için, bu gibi ılık PBS maruz doku için sürekli olarak uygulayarak doku nem korumak için, ameliyat boyunca vücut ısısı sürdürmek kritik önem taşır.
2. Betadine ile cildin sterilize edin. Steril makas kullanırken, sağ orta buzağı deri yoluyla orta hat kesi yapmak ve sağ uyluk üst kısmına dik keserek devam edin.
3. Iki yatay cilt insizyonlar üst kısmında her iki tarafında cilt flepleri oluşturmak için, dikey insizyonu satırı edin.
4. Vetbond her iki cilt kapakları aşağı çekin ve tutkal. Vetbond uygulamadan önce cildin gergin Çekme bacak istikrarı daha da teşvik edecek, ancak (vesse yani değişiklikler cilt gerginlik kan akışını tıkayan olmadığından emin olunl renk veya çapı). LN maruz kalmadan önce bacak istikrarı sağlamak için cildin diğer alanlarda aşağı tutkal devam edin. Fare boyutuna fazladan deri tutkal aşağı ne kadar belirleyecektir. Tipik olarak, büyük fareler, daha fazla deri sahibine yapıştırılabilir gerektirir.
5. LN sağa ya popliteal fossa içinde yalan veya popliteal ven sol,, tutucuya fare yerleştirme bağlı olmalıdır. Mikro diseksiyon cımbız ve forcepsi, çevreleyen yağ doku ve kasları LN dikkatle ayırın. Kanama ve travma en aza indirmek için, ayrı dokulara cımbız mikro diseksiyon ile ayırımını yapabilmek tekniklerini kullanın. Afferent ve efferent kan damarları ve afferent lenfatik damarların bütünlüğünü tehlikeye atmadan dikkatlice popliteal LN maruz kalmaktadır.
6. Kare cam kapak, eklenen doku istikrar için, damar tıkanıklığı kaçınarak sadece zar zor LN dokunmadan nemli LN üzerinde konumlandırılmış olabilir. Cam kapak secur olabilir, fare her iki tarafında kil modelleyerek ed.
7. Çeşitli boyutlarda (örneğin TRITC-dekstran, minimum 70kDa) Floresan gemi boyalar görüntüleme sırasında LN yapısal bir ilişki ve bütünlüğünü vurgulamak yardımcı olmak için bu noktada intravenöz sokulabilir.

4. 2-Foton Görüntüleme Toplama **

1. LN yeterince maruz kalır ve istikrar sağlandıktan sonra, hemen 37 tutulur bir çevre mikroskop odasında programlanabilir bir sıcaklık geri besleme kontrollü bir ısıtma yastığı ile donatılmış mikroskop sahne ° C üzerine tüm fare tutucu grubunu transfer Yeterince steril sıcak (37 ° C) PBS veya HBSS daldırın LN. Hacim, boyut ve yerleştirme fare bağlı olarak değişecektir. Alternatif olarak, sıcak PBS veya HBSS bir peristaltik pompa takılan ince bir cam pipet ile disseke LN doğrudan uygulanabilir ve daldırma objektif nesnel sütun bantlanmış olabilir. Sıvının akış olmalıdır biristikrarlı bir su sütunu lens ve doku arasında korunabilir.
2. Korumak PBS veya HBSS sıcaklık 37 ° C bir geri bildirim prob ile bir ısıtma pedi kullanarak. , 36.5 - 37.5 ° C aralığında bir sıcaklıkta PBS onaylamak için ayrı ayrı A sıcaklığı prob fare tutucu içindeki konulmalıdır Bir rektal prob görüntüleme oturum boyunca da deneysel fare çekirdek vücut ısısını izlemek için de kullanılıyor olabilir.
3. Objektif altında kılavuzu LN yerleştirme yardımcı olmak için bir epi-floresan lamba kullanın. Istediğiniz hücresel etkileşimi (her xyz görüntü yığını arasında genellikle 10 saniye ile 1 dakika) için uygun zaman aralıkları kullanılarak floresan görüntü yığınlarını edinin.
4. Monitör hayvan görsel kontrol ile veya bir hayvan izleme sistemi ile sık sık mikroskop odacık içinde durumu. Fare ayak ve / veya tırnak tutam yanıt eksikliği ile tam bir anestezi olup olmadığını belirlemek ve b 60-80 arasında istikrarlı bir olmayan emek, solunum hızıreaths / dak. Seviyesi arasında izofluran, hayvansal tamamen uyutulmamışsa emin olmak için, uygun şekilde ayarlanır. Uygun izleme ve hidrasyon ile, hayvanların 4-6 saat yansıması, ya da muhtemelen daha uzun olabilir.
5. Görüntüleme deneyden sonra, IACUC onaylı ötanazi protokolünü kullanarak CO ₂ odasında hayvan euthanize. Hayvan, ötanazi önce anestezi çıkmaya izin verilmemelidir.

. ** Cerrahi Bu prosedür ayrıca, diğer şekillerde, diğer 2P-LSM den intravital görüntüleme için faydalı olabilir.

5. Temsilcisi Sonuçlar

Çeşitli dolaşan bağışıklık hücreleri evlatlık transferi sonrasında farklı oranlarda LN alınırlar. CD4 ⁺ ve CD8 ⁺ lenfositlerin, bu hücreler 2 ila 4 saat sonra ^6,17-18, popliteal LN gelen önemli sayıda iv transferinden sonra yüksek endotelyal venül (HEV) dakika ile LN gelmeye başlar. B cel içinls, önemli bir sayı 8 ila 24 saat sonra, ¹⁹ birikebilir. Aktif, DC'ler ayak tabanına enjekte ^3,11,16-17 drenaj popliteal LN 8 ila 16 saat içinde görünmeye başlar. Şekil 2a diğer önemli yerleri bile olmadan, B hücresi folikül gibi yapılarda 2P-EKK ¹⁹ altında görülebilen yuvarlak küresel hücre birikimi ile kolayca ayırt edilebilir olduğunu gösterir. Ubikuitin-GFP splenositlerin (Şekil 2, Ek Videolar 1 ve 2) gibi endojen bir flüoresan raportör kullanarak, bir uyarıcı fizyolojik olmayan koşullarda haftada bir gün için bu lenfosit göçler ve davranışları izleyebilirsiniz. Multi-kanal yüksek hassasiyetli dedektörler sayesinde, birden fazla cep telefonu ortakları ^17,19 arasında yapısal bilgilerin yanı sıra etkileşim dinamikleri kapsayan bir multipleks görüntüleme veri elde etmek mümkündür.

cerrahi tekniklerin düzgün bir şekilde yürütülen ve çevre koşulları dikkatle izlenmelidir, lymphocytes karakteristik göç hızı, başka ^13-14,16 Şekil 2c, 2d ve gösterildiği gibi sergilemesi gerekir. Lenfositler de göç hızı LN uygulanan görüntüleme alt-bölgelere göre farklılık gösterebilir, kan damarları (gemi boyalarının giriş vurgulanır) kadar ek yerlerinden genel görüntü kalitesi (örneğin, uygun sıcaklık kontrolü belirlemenize yardımcı olacaktır , LN, vb minimal travma) ^3,6,20.

Şekil 1. Fare popliteal LN Görüntüleme için bir fare sahibinin İnşaat) fare sahibinin montaj Şemalar; b) Temsilcisi intravital fare hazırlanması; c) Tamamlanan fare tutucu grubunu; d) cerrahi maruz kaldıktan sonra popliteal LN görünümleri kapatın.

Şekil 2. GFP + lenfositlerin Göç analizipopliteal LN. (a) 6 / C57BL alıcı fare, popliteal LN 2P-EKK görüntüleme dizisi alınan 3D anlık adoptively öncesi görüntüleme ile 1x10 ⁷ GFP ⁺ lenfositlerin 1 gün transfer. Dash çizgi B hücreli köklerinin sınır ifade eder; (b) 1 saat boyunca sürekli görüntüleme lenfosit göç Tracks; genel lenfosit göç hızı c) Dağıtım. Ortalama hız = 10.04 ± 4.26 mm / dak (incelendi 15.125 parça toplam), d) B hücresi folikül hücreleri Diferansiyel hücresel göç hız dağılımı (açık çubuklar; ortalama toplam 1.525 parça incelendi; hız = 8.79 ± 3.90 mm / dak ) ve T hücre bölgesi (kapalı bar, ortalama hız = 13.77 ± 5.93 mikron / dk; toplam analiz 1.250 parçaları). Ölçek çubuğu = 50 mikron.

Ek Video 1, Şekil 2 'de anlatıldığı gibi bir fare popliteal LN Zaman aralıklı intravital 2P-LSM görüntüleme. Toplam 1x10 ⁷ lenfositler izole edildi from bir ubikuitin-GFP + donör fare ve C57BL / 6 alıcının fare içinde bir görüntüleme 24 saat önce damardan aktarılmasına adoptively. Xy (750 mm x 750 mm) bir dizi her 20 saniyede tekrarlanan bir xyz görüntüleme yığını (750 mm x 750 mm x 65 mm), floresans görüntüler elde etmek için sabit z yığınlarının (5 mikron adım, 13 adım) üzerinden alındı toplam 60 dakika, hız analizi (Şekil 2c, 2d) için bir xyzt görüntüleme sırası ile sonuçlanır. Çalma hızı = 450x. Ölçek çubuğu = 50 mikron. Zaman damgası = dk: sn. ek video izlemek için buraya tıklayın .

Ek B hücreli folikülü Kilavuz Video 1 görüntüleme dizisi görünümü Yakınlaştırırken - Video 2 T hücre bölgesine sınır. Çalma hızı = 450x. Ölçek çubuğu = 25 mikron. Zaman damgası = dk: sn Cek video izlemek için buraya yalamak.

Tartışmalar

In vivo dinamik hücresel davranış çalışmada artan bir ilgi özellikle situ görüntüleme teknikleri, 2P-EKK, yüksek çözünürlüklü son gelişmeler eşlik etmiştir. Canlı bir farenin popliteal LN 4D görüntüleme tekniği, bağışıklık hücrelerinin undisrupted doku mikro-çevre içinde dinamik davranışı, bu tür analizlere olanak sağlar. Tüm görünür spektrum yayılan birden fazla dedektörleri ile 2P-EKK kullanımı, aynı anda birden fazla hücre popülasyonlarının görüntüleme veri toplama izin verir. Bu şimdi kullanımını, organik floresan hücre boyalarının kullanılarak etiketli farklı hücre popülasyonlarının adoptif transferi ile birleştirilmiş hücre vivo-belirli bir flüoresan raportör fareler (örn. Ubiquitin-EGFP, RFP, ya da-eCFP) kullanımı ile elde edilebilir (örn. KAKE , SNARF-1 ve, LN içinde hücresel mekanizmaları ve işlevini incelemek için Hücre Tracker Turuncu). Farklı izlenir c arasındaki etkileşimler doğrudan gözlem ek olarakell nüfus, multipleks görüntüleme veri kümesi hücre davranış ve işlevi daha aydınlatmak için piyasada bulunan görüntü işleme yazılım programlarını (örneğin Imaris, BitPlane Inc) ile daha fazla analiz geçirebilmektedir. Olanakları geniş bir dizi, bu in vivo ve siliko teknikleri kullanarak hücresel etkileşim mekanizmaları incelemek için var.

Burada açıklanan deneysel yaklaşımın ana sınırlama cerrahi yaklaşım içinde doğasında olan teknik karmaşıklığı. Bu teknikle ilgili anatomi ve kesin bir teknik prosedürleri ve bu protokol gereği becerileri aşina olmak için sıkı bir eğitim gerektirir. Daha da karmaşık hale faktörler LN keşif sırasında doku hasarı en aza indirmek için zorluk, görüntüleme sırasında doku kararlılığını optimize eder ve önce LN termal ve lazer hasarı önlemede ve görüntüleme deney sırasında içerir. Bu faktörlerin biri Tedirgeme optimal daha az lenf neden olacaktırocyte motilite ve bu nedenle görüntüleme verileri analizler sonucunda uygun şekilde yorumlanması ile engel olacaktır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
İsofluranın, USP	Baxter Healthcare Corporation	NDC 10019-773-60
Vetbond	3M	1469SB
Nair - epilasyon losyon	Nair
, AMS, 1X	Cellgro	21-040-CV
Isıtma pedi	Watlow
Isıtma Pedi Denetleyici	Watlow
Hava ve O 2	Airgas
Sıcaklık probu	Harvard Apparatus
Cımbız Dumont # 5	Dünya Precision Instruments, Inc.	14101
Dünya Precision Instruments, Inc.	14141
Makas	Roboz Cerrahi Instrument Co, Inc.	RS-5880
Corning	70165-102
Corning	430.167
Betadine Çözüm (% 10 povidin İyot Topikal çözelti)	Purdue Ürünler, LP	NDC 67618-150-08