نموذج الفأر من MCAO داخل اللمعة: الدماغي التقييم عائق من قبل تلوين البنفسج الكريزيل

Summary

ويرد هنا في داخل اللمعة الأوسط نموذج انسداد الدماغي في الفئران. يتم تقييم مدى احتشاء دماغي من قبل على درجة عصبية والكريزيل تلطيخ البنفسجي، وهو بديل لتلطيخ TTC، وتقدم ميزة كبيرة لاختبار بالتوازي علامات الاهتمام عديدة.

Abstract

السكتة الدماغية هي ثالث سبب للوفيات والسبب الرئيسي للعجز في العالم. السكتة الدماغية الإقفارية حسابات لحوالي 80٪ من كل السكتات الدماغية. ومع ذلك، فإن الأنسجة منشط البلازمينوجين الحالة للخثرة (TPA) هو العلاج الوحيد من السكتة الدماغية الحادة موجود. هذا أدى إلى تطوير الباحثون عدة نماذج السكتة الدماغية في مجموعة متنوعة من الأنواع. وقد وضعت نوعين رئيسيين من النماذج القوارض: نماذج من نقص التروية الدماغية العالمية أو نقص التروية الدماغية البؤرية. لتقليد السكتة الدماغية في المرضى، ومنهم حوالي 80٪ السكتات الدماغية صمي تحدث الجلطة أو في إقليم الشريان الدماغي الأوسط (MCA)، وداخل اللمعة الأوسط انسداد الشريان الدماغي (MCAO) النموذج هو ذات الصلة تماما للدراسات السكتة الدماغية. كان أول من طور هذا النموذج في الفئران عن طريق كويزومي وآخرون في 1986 ^1. بسبب سهولة التلاعب الجيني في الفئران، كما تم تطوير هذه النماذج في هذا النوع ^2-3. المحتوى "> هنا، نقدم عابرة الإجراء انسداد MCA في C57/Bl6 الفئران. دراسات سابقة قد ذكرت أن الخصائص الفيزيائية للمطبق مثل قطر الحافة، الطول، الشكل، والمرونة هي حاسمة بالنسبة للاستنساخ من حجم احتشاء ^4. وهنا، تم استخدام السيليكون التجارية الأحادية المغلفة (Doccol شركة). آخر ميزة كبيرة هي أن هذا حيدة يقلل من خطر النزيف تحت العنكبوتية للحث. باستخدام المجهر ستيريو زايس STEMI 2000، عرض حيدة السيليكون المغلفة في الشريان السباتي الداخلي (ICA) عن طريق خفض في الشريان السباتي الخارجي (ECA) حتى حيدة occludes قاعدة MCA. تم استعادة تدفق الدم بعد 1 ساعة من إزالة حيدة لتقليد استعادة تدفق الدم بعد تحلل الجلطة من الانصمام الخثاري في البشر. يمكن تقييم مدى احتشاء دماغي الاولى لدرجة العصبية وقياس حجم احتشاء.وقد تم تحليل بالتالي الفئران الدماغية العصبية لدرجاتهم في أوقات ما بعد ضخه مختلفة. لتقييم حجم احتشاء، مع تلطيخ 2،3،5-triphenyltetrazolium كلوريد (TTC) تم تنفيذ عادة. هنا، كنا الكريزيل تلطيخ البنفسجي لأنه يتيح الفرصة لاختبار العديد من علامات الحرجة المناعية. في هذا الفيديو، ونحن التقرير الإجراء MCAO؛ عشرات العصبية وتقييم حجم احتشاء من تلطيخ البنفسجي الكريزيل.

Protocol

عابر انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO)

1. إجراء جراحة (الشكل 1)

يتم تنفيذ عابرة انسداد الشريان الدماغي الأوسط (tMCAO) في 2 - 3-لشهر ذكر العمر C57BL / 6 الفئران (22 28G). وقد وافق هذا البروتوكول من قبل الرعاية أخلاقيات علم الأحياء الحيوانية IRCM اللجنة. تم تعقيم الأدوات الجراحية بواسطة التعقيم (121 ° C في 15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 60 دقيقة). بين كل حيوان، وأنها معقمة باستخدام حبة الساخنة معقم (15 ثانية). ومطهرة طاولة الجراحة وغيرها من المعدات باستخدام الايثانول 70٪.

قبل ساعتين من الجراحة، وanalgesized الفئران مع البوبرينورفين (0.03 مغ / كغ bwip).

الرقم 1A.

1. تخدير الفئران مع بعمق 5٪ isoflurane ثم الحفاظ على التخدير عند 2.5٪ isoflurane. يتم الاحتفاظ درجة حرارة الجسم ثابتة من الفئران أثناء الجراحة مع وسادة التدفئة.
2. تطهير الفراء وSKفي الايثانول مع 70٪ أو Betadine. منذ الحلاقة تنتج الشعر الإفراج جزء، والتهاب microabrasions التي قد تؤثر على الفيزيولوجيا المرضية السكتة الدماغية، ونحن لا يحلق الفراء الماوس.
3. إجراء شق خط الوسط والرقبة برفق بعيدا عن الأنسجة الرخوة.
4. تحت المجهر ستيريو (STEMI 2000، زايس)، يتم تنفيذ عملية تشريح حادة لفضح القصبة الهوائية وسحب عضلات لتحديد موقع الشريان السباتي.
5. يتم تشريح بعناية اليسار الشريان السباتي المشترك (CCA) من الأنسجة المحيطة والمغطي مؤقتا CCA من قبل خياطة المؤقتة (1) باستخدام قطع خياطة الحرير 5-0 إلى 20 مم شرائح. ينبغي توخي الحذر الشديد عدم الاساءة الى العصب المبهم.
6. فصل والتشعب من الشريان السباتي الأيسر الداخلية المشتركة (ICA) والخارجية الشريان السباتي المشترك (ECA). يتم وضع خياطة دائمة (2) حول اللجنة الاقتصادية لأفريقيا، بشكل أقصى وقت ممكن، ويتم وضع آخر خياطة مؤقتة ضيق قليلا (3) على اللجنة الاقتصادية لأفريقيا إلى القاصيالتشعب.
7. مقطع ICA الأيسر (4) باستخدام ملاقط عكس العمل لتجنب النزيف. ينبغي توخي الحذر الشديد عدم الاساءة الى العصب المبهم.
8. قطع ثقب صغير في اللجنة الاقتصادية لأفريقيا (5) بين الغرز (3) دائم (2) ومؤقتة.

الرقم 1B.

9. إدخال 12 ملم لمدة 6-0 المغلفة السيليكون (حوالي 10MM-9 هو السيليكون مغلفة) خياطة حيدة (شركة Doccol) في اللجنة الاقتصادية لأفريقيا (6)، وقطع تماما ECA البعيدة للخياطة ودائم في قلب مطبق في ICA . ويرتبط بإحكام حول خياطة حيدة لمنع النزيف ويتم إزالة ملاقط عكس العمل.
10. وقدم مطبق لتسد أصل MCA في دائرة ويليس. وقف الإدراج في جميع أنحاء 9-10 ملم إلى ما بعد التشعب من اللجنة الاقتصادية لأفريقيا والتقييم القطري المشترك. يتم حظر مطبق و لا يمكن نقل بعد الآن. يجب الحرص على عدم اختراق الشريان الحنكي. الخيط (3) على اللجنة الاقتصادية لأفريقيا هو TIGتعادل htly لإصلاح حيدة في الموقف.
11. إغلاق الجلد مع إغلاق نظام autoclip الجرح.
12. حقن 1 مل من محلول ملحي تحت الجلد ووضع الفئران تحت مصباح الأشعة تحت الحمراء التدفئة خلال فترة ما بعد كل انسداد في (60 دقيقة).

2. استعادة الشريان المخي الأوسط تدفق الدم

قبل reanesthesia، يمكن التحقق من neuroscore لتقييم مدى نجاح العملية الجراحية.

1. تخدير الفئران كما هو موضح سابقا وإزالة autoclips.
2. فتح قليلا خياطة (3) على اللجنة الاقتصادية لأفريقيا للسماح بانسحاب حيدة وضخه الدم.
3. ربط بشكل دائم قبالة خياطة مؤقت على اللجنة الاقتصادية لأفريقيا لمنع فقدان الدم. يتم الاحتفاظ حيدة لإعادة الاستخدام.
4. إزالة خياطة المؤقتة (1) على التقييم القطري المشترك للسماح إعادة تدوير الدم.
5. إغلاق الجرح. ينبغي أن الفئران تلقي حل آخر 1 مل تحت الجلد المالحة.
6. وضع الفئران تحت مصباح الأشعة تحت الحمراء التدفئة لمدة 1 ساعة. بعد التحقق من أن تستعيد الحركة الحيوانية، يتم إرجاع الماوس لقفصه وترك تحت وسادة التدفئة لمدة 72 ساعة المناشف. لاحظ أن يتم وضع سوى نصف القفص على منصة التدفئة للسماح لاختيار الفئران بيئتهم. لأنه لوحظ بشكل عام بعد الجراحة وفقدان الوزن، يتم وضع الطعام المهروسة في طبق بتري لتشجيع تناول الطعام.
   اثنتي عشرة ساعة بعد الجراحة، تلقت الفئران جرعة أخرى من البوبرينورفين (0.03 مغ / كغ bwip).

3. عملية الشام

لعمليات الشام، وجميع الإجراءات متطابقة إلا أن لم يتم إدخال مطبق.

4. Neuroscore

العجز العصبية تسمح تقييم نجاح tMCAO بعد ضخه في وقت لاحق وتقدير درجة خطورة الاصابة. وسجل العجز العصبية كما هو موضح سابقا ^{5 <}/ سوب> وأجريت في 1، 24، 48 و 72 ساعة بعد ضخه. يتم استخدام موسع نطاق ست نقاط:

• 0: عادي.
• 1: خفيف تحلق السلوك مع أو بدون التناوب غير متناسقة عند التقطت من ذيله، <محاولات لتدوير 50٪ إلى الجانب المقابل.
• 2: معتدل يتفق تحلق،> محاولات لتدوير 50٪ إلى الجانب المقابل.
• 3: يتفق قوية وفورية تحلق، الماوس يحتفظ بمكانة التناوب لأكثر من 1-2 ثانية، مع أنفها تصل الى نحو ذيله.
• 4: دوران شديد تتقدم الى إنطلاق، وفقدان المشي أو المنعكس التقويمي.
• 5: غيبوبة أو المحتضرة.

5. الكريزيل تلوين البنفسج (الشكل 2)

بعد نضح حل PBS، يتم تجميد العقول بسرعة في نظير البنتان وتخزينها في -80 درجةقد يكون C. أدمغة فئران perfused أيضا مع بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) اعتمادا على دراسات المناعية المخطط لها. يتم تنفيذ ناظم البرد، تخفيضات من أقسام الدماغ الاكليلية (17 ميكرون). يتم جمع مقطع واحد من كل 30 على الشريحة نفسها أن يكون لها ممثل الإصابة الدماغية. لحجم الكمي، ملطخة 2 شرائح من تلطيخ البنفسجي الكريزيل ونظام تحليل الصور تم استخدام (المطعوم شركة، فريدريك، MD) لتقييم الآفة. تم حساب حجم الإصابة في وحدات التعسفي (بكسل)، ومعبرا عنها كنسبة مئوية من المساحة غير lesioned المقابل لكل قسم. يتم الاحتفاظ الشرائح الأخرى في C ° -80 للدراسات المناعية. وبدلا من ذلك، يمكن خفض PFA ثابتة في الدماغ 30-50 ميكرون باستخدام vibratome وحجم احتشاء قياس ما أوصت به هان وآخرون (2009) ^6.

النتائج

تقييم neuroscore يؤكد نجاح tMCAO بعد السكتة الدماغية ويحدد كفاءة tMCAO بعد ضخه. في أيدينا، وجميع الفئران إخضاعها لإجراءات داخل اللمعة قدم ما لا يقل عن الشباك خفيفة متناسقة (neuroscore 2) وعجز عصبي مستقرة عموما تصل إلى 72 ساعة. معظم الفئران يحمل الشباك خفيفة متناسقة (neuroscore 2). ويستثنى الفئران تبين عدم وجود الشباك من الدراسة. ومع ذلك، فإن التقييم neuroscore لا تسمح لنا أن نميز بين الفئران مع الحصين الجرحى وأولئك الذين لديهم قرن آمون سليمة.

لم يلاحظ أي وفيات خلال اليوم لعملية جراحية، مما يوحي بأن نزيف تحت العنكبوتية لم يحدث. عندما يتم التعرف نزيف تحت العنكبوتية في الماوس، يتم استبعاد منهجي هذا واحد من التحليل. استخدام السيليكون المغلفة حيدة من شركة Doccol، وهو أكثر سلاسة من المنزل استعدادا الأحادية، ويزيد من نجاحtMCAO ويقلل نزيف تحت العنكبوتية. وفيات بين 24 ساعة وساعة 72 هو 14٪ في هذا النموذج، كما ذكرت عموما لمدة 60 دقيقة من الانسداد. وفيات وحظ ربما يرجع إلى وحدة تخزين كبيرة احتشاء في هذه السلالة الماوس. A استنساخ الآفة قوية كما لوحظ (الانحراف المعياري هو 15٪)، والتي هي مثيرة جدا للاهتمام لدراسة الجزيئات العصبية التي يمكن أن تكون مخفية تأثيرها (ق) من التباين للنموذج.

لتقييم مدى إصابة الدماغ بعد tMCAO، اخترنا لاستخدام الكريزيل تلطيخ البنفسجي (الشكل 2) بدلا من TTC من أجل الحصول على الكثير من المواد ذات الصلة لاختبار علامات ^6. مدى الآفة يتسق نسبيا. ومع ذلك، لاحظنا أنه في بعض الفئران، أصيب قرن آمون (حوالي 30٪ من الفئران). ومن المثير للاهتمام أن نلاحظ أن يمكن تطبيق تلطيخ البنفسجي الكريزيل تصل إلى 1 بعد أسبوع. في الأدب، واحتشاء الدماغ نسبة تختلف مندراسة إلى أخرى. ذلك يعتمد على اختيار سلالة الفأر، والتخدير، وسمك أقسام الدماغ، وحيدة تستخدم، أو تستخدم تلطيخ ^{6 و 7.}

الشكل 1. مخطط انسداد الشريان الدماغي الأوسط في استخدام السيليكون المغلفة حيدة داخل اللمعة. A المخطط. المبسطة الدماغ والشرايين الدماغية الماوس تظهر الغرز المتعاقبة ومقطع لإعداد مقدمة من السيليكون المغلفة حيدة. B. ويمثل موقف حيدة من خلال دائرة ويليس. وقدم حيدة في ICA عبر اللجنة الاقتصادية لأفريقيا تسد قاعدة ACA MCA، الشريان المخي الأمامي؛ BA، الشريان القاعدي؛ CCA، الشريان السباتي المشترك؛ C. ويليس، دائرة ويليس، اللجنة الاقتصادية لأفريقيا، الخارجية السباتي آرتيراي؛ ICA، الداخلية الشريان السباتي؛ MCA الشريان الأوسط، الدماغي، PCA، الاتصال الشريان الخلفي؛ PPA، الشريان الحنكي.

الشكل 2. أقسام الاكليلية ممثل مخ الفأر ملطخة البنفسجي الكريزيل بعد 72 ساعة بعد ضخه منطقة عائق. (المخطط أساسا، والقشرة مناطق الدماغ المجاورة) يظهر باللون الأبيض (غير ملوثين من البنفسجي الكريزيل). بلغ حجم الإصابة (الجزء الأبيض، النصف الأيمن) محدد، وأعرب عن كنسبة مئوية من المساحة غير lesioned المقابل (نصف الكرة المخية الأيسر).

Discussion

وقد تم تطوير نماذج مختلفة السكتة الدماغية السكتة الدماغية لتقليد الآثار في المرضى. اختيار نموذج السكتة الدماغية يعتمد على مسألة البيولوجية. نموذج يحاكي MCAO داخل اللمعة واحدة من الأنواع الأكثر شيوعا من السكتة الدماغية في المرضى وأقل الغازية وأكثر اتساقا من النموذج تامورا ^4،7. بل هو نموذج للاهتمام حقا لتحاليل الموت العصبية، وneurorepair الخلية. نجاح النموذج داخل اللمعة يعتمد على العديد من العوامل مثل الجنس الحيوانية والعمر والوزن ودرجة الحرارة، والتخدير ووقت الجراحة، والتي لا بد من السيطرة عليها. والآداب المادي للمطبق (قطر الحافة، وطول وشكل وfexibility) هي الحاسمة لاتساق MCAO ^4. هنا، ونحن نستخدم 12 ملم لمدة 6-0 حيدة المغلفة مع السيليكون في 9-10 مم من شركة Doccol. ميزة كبيرة لهذا حيدة هو الحد من نزيف تحت العنكبوتية، ولأن طوله يغطي جميع ICAيتم منع الطول، تدفق الدم المتبقية، والتي تأتي من الشرايين الأمامية والخلفية من دائرة التواصل ويليس والمؤسسة العامة للتقاعد، و ⁸ التباين في انخفاض حجم احتشاء (15٪ من التباين في أيدينا). الخيط من CCA يقلل أيضا من تباين حجم احتشاء ^9.

ويمكن تقييم مدى إصابة الدماغ tMCAO التالية بطرق مختلفة. ويمكن قياس العجز العصبية كما ذكر سابقا. ومع ذلك، فإنه من الصعب أن يكون هناك مقياس كفاءة من خلال هذا الطريق. عادة يتم تنفيذ مدى احتشاء من تلطيخ TTC. وفي الآونة الأخيرة، كما تستخدم تقنيات الرنين المغناطيسي، وهي تقنية مثيرة للاهتمام بشكل خاص لعلاج الأعصاب. لفهم الآليات الكامنة الخلوية المشاركة في مثل السكتة الدماغية الموت neurorepair الخلية، أو تكاثر الخلايا، ودراسة علامات مختلفة عن طريق أمر بالغ الأهمية المناعية ومفيدة للغاية. وهكذا، لدينا protocرأ من الاستعدادات القسم الدماغ لديه ميزة كبيرة بالسماح لهذه التحليلات، ويقلل من عدد من الفئران المستخدمة. وعلاوة على ذلك، وآخرون Tureyen ¹⁰ وأفادت أن هناك علاقة جيدة بين البنفسجي تلطيخ الكريزيل وTTC.

Materials

ستيريو المجهر	زايس	STEMI 2000
الألياف عالية الكثافة الخفيفة المنور	دولان-جينر شركة الصناعات
نظام التخدير لisoflurane
CDMV	108737
التدفئة بطانية	Gaymar Medsearch	TP22G
مصباح الأشعة تحت الحمراء التدفئة
الترا غرامة ملاقط، على غرار 5	العلوم المجهر الإلكتروني	78320-5TI
Vannas مقص 3 طليعة مم، مستقيم	العلوم المجهر الإلكتروني	72932-01
نمط LA-1 و 1-MPF جميع شفرات ناعمة	العلوم المجهر الإلكتروني	77926-5S
ملاقط العمل السلبي، KOPINC أسلوب 5	العلوم المجهر الإلكتروني	72850-F
تشريح مقص 5 1/2 "مستقيم	Cedarlane	72960
Autoclip كاتب مجموعة	هارفارد جهاز	34-0557
فيشر	01-804-5
5-0 خياطة	هارفارد جهاز	517763
خياطة المواد حيدة II PDS البنفسجي، 5-0، RB-1؛ Z303H	CDMV	6167
12 ملم لمدة 6-0 خياطة حيدة المغلفة السيليكون	شركة Doccol	60SPRePK5
Seringes 1ML	فيشر	14-823-2F
إبر 26G1 / 2	فيشر	BD-305111
IRCM