Maus-Modell der Intraluminal MCAO: Hirninfarkt Evaluation durch Cresylviolett Staining

Zusammenfassung

Der intraluminale cerebri Okklusion in Mäusen wird hier vorgestellt. Das Ausmaß der Hirninfarkt wird durch eine neurologische Partitur und Cresylviolett Färbung, eine alternative Färbung zur TTC bietet den großen Vorteil, dass sie parallel viele interessante Marker testen ausgewertet.

Zusammenfassung

Schlaganfall ist die dritthäufigste Todesursache und die führende Ursache von Behinderungen in der Welt. Der ischämische Schlaganfall macht etwa 80% aller Schlaganfälle. Jedoch ist das thrombolytische Gewebeplasminogenaktivator (tPA) die einzige Behandlung von akutem ischämischem Schlaganfall, das existiert. Dies veranlasste die Forscher zu mehreren ischämischen Schlaganfall-Modelle in einer Vielzahl von Arten zu entwickeln. Zwei Haupttypen von Tiermodellen entwickelt worden: Modelle der globalen zerebralen Ischämie oder fokaler zerebraler Ischämie. Um einen ischämischen Schlaganfall bei Patienten zu imitieren, in denen rund 80% thrombotische oder embolische Schlaganfälle treten im Gebiet der mittleren zerebralen Arterie (MCA), die intraluminale Mitte Zerebralarterie (MCAO) Modell ist durchaus relevant für Schlaganfall Studien. Dieses Modell wurde zunächst in Ratten durch Koizumi et al. In 1986 ^1. Wegen der Leichtigkeit der Genmanipulation in Mäusen wurden diese Modelle auch in dieser Spezies ^2-3 entwickelt. Inhalt "> Hier präsentieren wir die transiente MCA-Okklusion Verfahren C57/BL6-Mäusen. Frühere Studien haben berichtet, dass die physikalischen Eigenschaften des Okkluder wie Tip Durchmesser, Länge, Form und Flexibilität entscheidend für die Reproduzierbarkeit der Infarktvolumen ⁴ sind. Hier ein kommerzielles Silikon beschichtete Monofilamente (Doccol Corporation) verwendet wurden. Ein weiterer großer Vorteil ist, dass diese Monofilament das Risiko für Subarachnoidalblutungen Erbrechen reduziert. Mit dem Zeiss Stereomikroskop Stemi 2000 wurde das Silizium beschichtet Monofilament in die Arteria carotis interna eingeführt (ICA) über einen Schnitt in der Arteria carotis externa (ECA), bis das Monofilament verschließt die Basis der MCA. Blutfluss 1 Stunde später wurde durch Entfernen des Monofilaments, um die Wiederherstellung des Blutflusses nach Lyse einer thromboembolischen Gerinnsels in imitieren wiederhergestellten Menschen. Das Ausmaß von Hirninfarkt zunächst durch eine neurologische Tor und durch die Messung des Infarktvolumen ausgewertet werden.Ischämische Mäuse wurden damit für ihre neurologische Score bei unterschiedlichen post-Reperfusion mal analysiert. Um das Infarktvolumen auszuwerten, Färbung mit 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) wurde gewöhnlich durchgeführt. Hier haben wir Cresylviolett Färbung, da es die Möglichkeit, viele Anflugbaken durch Immunhistochemie testen bietet. In diesem Video berichten wir über die MCAO Verfahren; neurologischen Scores und die Auswertung der Infarktvolumen durch Cresylviolett Färbung.

Protokoll

Transient Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO)

Ein. Chirurgie Procedure (Abbildung 1)

Transient Mitte Zerebralarterie (tMCAO) auf 2 durchgeführt - bis 3-Monate alten männlichen C57Bl / 6 Mäuse (22-28g). Dieses Protokoll wurde von der IRCM Bioethik-Ausschusses animal care zugelassen. Chirurgische Instrumente wurden durch Autoklavieren (121 ° C bei 15 psi für 60 min) sterilisiert. Zwischen jedem Tier wurden sie sterilisiert durch die Hot-Sterilisator Wulst (15 sec). Operationstisch und andere Geräte werden gereinigt unter Verwendung von 70% Ethanol.

Zwei Stunden vor der Operation wurden die Mäuse mit Buprenorphin (0,03 mg / kg BWIP) analgesized.

1A.

1. Tief betäuben Mäuse mit Isofluran 5% und pflegen die Narkose mit 2,5% Isofluran. Körpertemperatur der Mäuse erhalten bleibt während der Operation mit einem Heizkissen konstant.
2. Desinfizieren Sie das Fell und skMit 70% Ethanol oder Betadine. Da Rasur produziert Haare Fragment Release microabrasions und Entzündungen, die zum Schlaganfall Pathophysiologie auswirken können, wissen wir nicht rasieren Maus Fell.
3. Machen Sie eine Mittellinie Hautschnitt und ziehen neben die Weichteile.
4. Unter einem Stereomikroskop (Stemi 2000, Zeiss) ist ein stumpf ausgeführt, um die Luftröhre freizulegen und Rückziehen der Muskeln um die Halsschlagader lokalisieren.
5. Die linke Arteria carotis communis (CCA) wird vorsichtig vom umgebenden Gewebe seziert und die CCA wird vorübergehend durch einen temporären Nahtmaterial (1) mit 5-0 Seidenfaden Schnitt in 20 mm-Segmente okkludiert. Große Vorsicht ist geboten, nicht die Vagusnerv schaden.
6. Trennen Sie die Gabelung des linken inneren Halsschlagader (ICA) und externe Arteria carotis communis (ECA). Eine permanente Nahtmaterial (2) um den ECA platziert, so distal wie möglich und eine weitere temporäre Nahtmaterial geringfügig eng (3) auf dem ECA platziert distal desBifurkation.
7. Befestigen Sie den linken ICA (4) mit einem Reverse-Action-Pinzette zu vermeiden Blutungen. Große Vorsicht ist geboten, nicht die Vagusnerv schaden.
8. Schneiden Sie ein kleines Loch in ECA (5) zwischen permanenten (2) und temporäre (3) Nähte.

Abbildung 1B.

9. Einführung einer 12 mm langen 6-0 silikonbeschichtetes (ca. 9-10mm liegt beschichteten Silizium) Monofilamentnahtmaterial (Doccol Corporation) in die ECA (6), die vollständig abgeschnitten ECA distal zum permanenten Nahtmaterial und invertieren die Verschließplatte in das ICA . Die Naht wird eng um den Monofilament zur Vermeidung von Blutungen gebunden und die Reverse-Aktion-Pinzette entfernt werden.
10. Das Okkluder wird eingeführt, um den Ursprung des MCA im Kreis Willis okkludieren. Stoppen seiner Einführung rund 9-10 mm über der Bifurkation ECA und CCA. Der Okkluder ist blockiert und kann sich nicht mehr bewegen. Sorgfalt ist nicht die pterygopalatina Arterie eindringen. Die Naht (3) auf dem ECA ist tightly gebunden an das Monofilament in Position zu fixieren.
11. Schließen Sie die Haut mit einem AutoClip Wundverschluss System.
12. Jeweils 1 ml Kochsalzlösung subkutan und legen Mäuse unter einer Infrarot-Wärmelampe während der gesamten post-Okklusion Zeitraum (60 min).

2. Restoration of Middle Cerebral Artery Blood Flow

Bevor reanesthesia kann die neuroscore überprüft, um den Erfolg der Operation zu evaluieren.

1. Anästhesieren die Mäuse, wie oben beschrieben und entfernen autoclips.
2. Leicht öffnen die Naht (3) auf der ECA für Monofile Rückzug und Blutreperfusion ermöglichen.
3. Dauerhaft binden Sie das temporäre Naht auf der ECA, um den Blutverlust zu verhindern. Das Monofilament wird zur Wiederverwendung aufbewahrt.
4. Entfernen des temporären Nahtmaterial (1) auf dem CCA zu Blutrezirkulation ermöglichen.
5. Schließen Sie die Wunde. Die Mäuse sollten weitere 1 ml Kochsalzlösung subkutan erhalten.
6. Legen Sie die Mäuse unter der Infrarot-Wärmelampe für 1 Stunde. Nach der Überprüfung, dass das Tier Mobilität wiedererlangt, wird die Maus in seinen Käfig zurück und verließ unter dem Heizkissen und Handtücher für 72 Stunden. Beachten Sie, dass nur die Hälfte des Käfigs auf dem Heizkissen gebracht wird, damit Mäusen auf ihre Umgebung zu wählen. Da post-chirurgischen Gewichtsverlust in der Regel beobachtet wird, wird püriert Essen in einer Petrischale zu ermutigen essen platziert.
   Zwölf Stunden nach der Operation erhielten die Mäuse eine weitere Dosis von Buprenorphin (0,03 mg / kg BWIP).

3. Sham Betrieb

Für Scheinoperationen sind alle Verfahren identisch, außer dass der Okkluder ist nicht eingesetzt.

4. Neuroscore

Neurologische Ausfälle erlauben die Beurteilung des Erfolgs der tMCAO kurz nach Reperfusion und später die Schätzung der Grad der Schwere der Verletzung. Neurologische Defizite hat wie zuvor ⁵ beschrieben ^</ Sup> und trat auf 1, 24, 48 und 72 h nach Reperfusion. Eine erweiterte sechs-Punkte-Skala verwendet wird:

• 0: normal.
• 1: mild Drehverhalten mit oder ohne Widerspruch Drehung, wenn durch den Schwanz hob, <50% Versuche zur Gegenseite drehen.
• 2: mild konsequente kreisen,> 50% Versuche zur Gegenseite drehen.
• 3: einheitliche starke und unmittelbare kreisen, hält die Maus eine Drehung Position für mehr als 1-2 sec, mit der Nase fast auf dem Schwanz.
• 4: schwere Drehung voran in Trommelpolieren, Verlust des Gehens oder Stellreflexes.
• 5: komatösen oder sterbender.

5. Cresylviolett Färbung (Abb. 2)

Nach Perfusion PBS-Lösung, werden Gehirne schnell in Isopentan eingefroren und bei -80 °C. Maus Gehirn kann auch mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in Abhängigkeit von den geplanten Immunhistochemie Studien perfundiert werden. Kryostat-Schnitten von koronalen Gehirnschnitte (17 um) werden durchgeführt. Einem Abschnitt aus jedem 30 ist auf derselben Folie gesammelt, um einen repräsentativen cerebralen Verletzungen aufweisen. Für Volumen Quantifizierung, sind 2 Folien durch Cresylviolett Färbung und einem Bildanalysesystem gefärbt (Scion Corporation, Frederick, MD) verwendet wurde, um die Läsion zu bewerten. Die Verletzung Volumen wurde in willkürlichen Einheiten (Pixel) berechnet und ausgedrückt als Prozentsatz der kontralateralen nicht-verletzten Bereich für jeden Abschnitt. Andere Folien werden bei -80 ° C für die Immunhistochemie Studien gehalten. Alternativ kann PFA-fixierten Gehirns bei 30-50 um unter Verwendung Vibratom und die Infarktvolumen gemessen wie von Han et al. (2009) ⁶ empfohlen geschnitten werden.

Ergebnisse

Die Auswertung neuroscore bestätigt den Erfolg tMCAO nach Schlaganfall und bestimmt die Effizienz des tMCAO post-Reperfusion. In unseren Händen, alle Mäuse an der intraluminalen Verfahrens vorgestellt mindestens eine milde konsistente Locken (neuroscore 2) und den neurologischen Defiziten im allgemeinen stabil sind bis zu 72 h unterzogen. Die meisten Mäuse zeigen eine milde konsequente Curling (neuroscore 2). Mäusen zeigt Abwesenheit Curling werden von der Studie ausgeschlossen. Allerdings ist die neuroscore Evaluierung uns nicht erlauben, zwischen Mäusen mit einem verletzten Hippokampus und jene mit einem intakten Hippokampus unterscheiden.

Es wurde keine Mortalität während der Operation Tag beobachtet, was darauf hindeutet, dass Subarachnoidalblutungen traten nicht auf. Wenn Subarachnoidalblutung in einer Maus identifiziert wird, wird dies ein systematisch von der Analyse ausgeschlossen. Die Verwendung von Silizium-beschichtetem Monofilament aus Doccol Corporation, die glatter als Hause zubereiteten Monofilamente ist, erhöht den ErfolgtMCAO und reduziert Subarachnoidalblutungen. Mortalität zwischen 24 h und 72 h liegt bei 14% in diesem Modell, wie es allgemein für 60 min der Okklusion gemeldet. Die Mortalität beobachtet beruht wahrscheinlich auf einer großen Infarktvolumen in diesem Mausstamm. Eine starke Läsion Reproduzierbarkeit wurde auch beobachtet (Standardabweichung beträgt 15%), was sehr interessant, Neuroprotektion Moleküle, wo ihre Wirkung (en) durch die Variabilität des Modells versteckt werden studieren.

Um das Ausmaß der Hirnschädigung nach tMCAO auszuwerten, entschieden wir uns für Cresylviolett Färbung (Abbildung 2) statt TTC nutzen, um über eine Menge von Materialien zu testen relevante Marker ^6. Das Ausmaß der Läsion ist relativ konsistent. Allerdings haben wir festgestellt, dass in einigen Mäusen, der Hippocampus verletzt wurde (rund 30% der Mäuse). Es ist interessant festzustellen, dass Cresylviolett Färbung bis zu 1 Woche später aufgebrachten werden. In der Literatur, variiert der Prozentsatz der von einem Hirninfarktstudieren zum anderen. Es hängt von der Wahl der Mausstamm, der Anästhesie, der Dicke Gehirnschnitte, dem Monofilament verwendet, oder die Färbung verwendete ^{6, 7.}

Abbildung 1. Schema der Verschluss der mittleren Hirnarterie Verwendung von Silizium-beschichtete intraluminale Monofilament. A. Vereinfachtes Schema Mäusehirn und Hirnarterien zeigt aufeinanderfolgenden Nähten und Clip um die Einführung von Silikon-beschichteten Monofilament vorzubereiten. B. Die Lage der Monofile durch den Kreis der Willis dargestellt. Das Monofilament wird in ICA über ECA eingeführt, um die Basis des MCA ACA, anterioren zerebralen Arterie zu verschließen;. BA, A. basilaris, CCA, Arteria carotis communis, C. Willis, Willis; ECA, carotis externa artery, ICA, A. carotis interna, MCA, mittlere Hirnarterie, PCA, posterior kommunizieren Arterie; PPA, pterygopalatina Arterie.

Abbildung 2. Vertreter koronalen Abschnitte Gehirn der Maus mit Kresylviolett nach 72 h nach Reperfusion. Infarkt-Bereich (vor allem Striatum, Cortex und den angrenzenden Hirnregionen) gefärbt erscheint in weiß (unbefleckt von Cresylviolett). Die Verletzung Volumen (weißer Teil der rechten Hemisphäre) war abgegrenzt und ausgedrückt als Prozentsatz der kontralateralen nicht-verletzten Bereich (linke Hemisphäre).

Diskussion

Unterschiedliche Takt Modelle wurden entwickelt, um Schlaganfall Folgen bei Patienten zu imitieren. Die Wahl des Hubs Modell abhängig vom biologischen Frage. Der intraluminale MCAO Modell imitiert eine der häufigsten Arten von ischämischen Schlaganfall bei Patienten und ist weniger invasiv und konsequenter als die Tamura Modell ^4,7. Es ist ein wirklich interessantes Modell für Neuroprotektion, Neuroreparatur und Zelltod Analysen. Der Erfolg des intraluminalen Modells hängt von vielen Faktoren wie tierische Geschlecht, Alter und Gewicht, Temperatur, Anästhesie und zum Zeitpunkt der Operation, die gesteuert werden müssen. Die physikalischen Anstandsregeln des Okkluder (Spitze Durchmesser, Länge, Form und flexibilität) sind entscheidend für die Konsistenz des MCAO ^4. Hierbei verwenden wir die 12 mm langen 6-0 Monofilament mit Silizium auf 9-10 mm von Doccol Konzern beschichtet. Der große Vorteil dieser Monofilament ist Subarachnoidalblutungen reduzieren und weil seine Länge bedeckt alle ICALänge, Fehlerstrom Durchblutung, die von den vorderen und hinteren kommunizieren Arterien des Circle of Willis und PPA kommt, wird verhindert und die Variabilität in den Infarktvolumen abnimmt (15% der Variabilität in unseren Händen) ^8. Nahtmaterial nach CCA sinkt auch die Variabilität des Infarktvolumen ^9.

Das Ausmaß der Hirnverletzung folgenden tMCAO können von verschiedenen Arten bewertet werden. Neurologische Defizite gemessen, wie zuvor erwähnt werden. Jedoch ist es schwierig, eine effiziente Maßnahme diesem Weg haben. Das Ausmaß des Infarkts wird üblicherweise durch TTC Färbung durchgeführt. In jüngerer Zeit sind Kernspintomographie ebenfalls verwendet, eine besonders interessante Technologie für neuroprotektive Behandlungen. Um die zugrunde liegenden zellulären Mechanismen bei Schlaganfall wie Neuroreparatur, Zelltod oder Zellproliferation beteiligt zu verstehen, ist die Untersuchung der verschiedenen Marker immunhistochemisch kritischen und sehr informativ. So, unsere Protokollol des Gehirns Abschnitt Vorbereitungen hat den großen Vorteil, dass diese Analysen und minimiert die Anzahl der Mäuse verwendet. Außerdem Tureyen et al. ¹⁰ haben berichtet, dass es eine gute Korrelation zwischen Cresylviolett Färbung und TTC.

Materialien

Stereo-Mikroskop	Zeiss	Stemi 2000
Fiber-Light High Intensity Illuminator	Dolan-Jenner Industries Inc.
Anästhesie-System für Isofluran
Isofluran	CDMV	108737
Heizdecke	Gaymar Medsearch	TP22G
Infrarot-Wärmelampe
Ultra feinen Pinzette, style 5	Electron Microscopy Sciences	78.320-5TI
Vannas Schere 3 mm Cutting Edge, Straight	Electron Microscopy Sciences	72932-01
Style LA-1 und MPF-1 Alle glatte Klingen	Electron Microscopy Sciences	77.926-5S
Negative Aktion Pinzette, Style KOPINC 5	Electron Microscopy Sciences	72.850-F
Präparierschere 5 1/2 "Straight	Cedarlane	72960
Autoclip Starter-Set	Harvard Gerät	34-0557
BD Autoclip Wundverschluss Syst., 9mm lang, 100 St.	Fisher	01-804-5
5-0 Nahtmaterial	Harvard Gerät	517763
Nahtmaterial PDS II Monofilament Violett, 5-0, RB-1; Z303H	CDMV	6167
12 mm langen 6-0 silikonbeschichtetes Monofilamentnahtmaterial	Doccol Konzern	60SPRePK5
Seringes 1ml	Fisher	14-823-2F
Needles 26G1 / 2	Fisher	BD-305111
IRCM